从基础到进阶：PCR、qPCR 和 RT-PCR 不是一回事儿？(内含 Protocol)

生物科研实验室

01各类 PCR ，分不清？
PCR (Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，反应体系中加入 dNTP、Mg2+ 等原料，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程，可快速特异性地在体外扩增目的 DNA
PCR 在基础科学研究 (如基因功能分析、基因检测)、医学诊断 (如病原体检测和遗传病筛查)、法医鉴定 (如身份鉴定) 以及环境监测 (如生物多样性研究) 等具有广泛的应用，是现在生物技术和遗传研究的核心工具。
02 常规 PCR
PCR 的基本成分包括模板 DNA、引物、反应缓冲液、游离核苷酸、聚合酶、盐和水 (不含核酸酶和污染 DNA) 等。只要目标区域两侧的碱基序列 (寻找的特定 DNA 序列)是已知的，几乎任何 DNA 区域都可以作为 PCR 扩增的模板
03 实时荧光定量 PCR (qPCR)
实时荧光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) 是 DNA 的实时 PCR 扩增，通过荧光探针测量，最常见的是插入染料或基于水解的探针，从而实现 PCR 产物的定量 (见图 2)。该技术常用于检测病原体的存在和确定感兴趣的 DNA 序列的拷贝数。
04 逆转录 PCR (RT-PCR)
逆转录 PCR (Reverse transcription PCR, RT-PCR) 可使用 RNA 作为模板生成互补 DNA (cDNA)。利用逆转录酶，产生 cDNA 的单链拷贝。然后，这可以通过 DNA 聚合酶扩增，产生双链 cDNA，进入基于 PCR 的标准扩增过程 (图 4A)。该技术可用于目标基因 (GOIs) 的分子克隆，其可研究用抑制剂、兴奋剂、小干扰 RNA (siRNA) 或敲除模型等处理模型系统后基因表达的变化。这项技术也经常用于检测 RNA-Seq 实验之前 (作为质量控制) 和之后 (确认变化) 的表达变化。
05 数字 PCR (dPCR)
数字 PCR (Digital PCR, dPCR) 是目前可用的另一种强大技术，在临床诊断中有着广泛的应用。其中，dPCR 方法用于液体活检中的癌症监测和器官移植排斥监测等应用，这两种方法都基于检测患者样本中低丰度的无细胞 DNA[13]。dPCR 技术的原理 (图 5) 涉及将具有制备的 PCR 溶液的样本分离成大量分区 (通常为纳升大小的液滴)，其中单独进行 PCR 反应。每个分区包含零个、一个或几个目标 DNA 副本，遵循泊松分布 (Poisson distribution)。
06 小结
PCR 技术是分子生物学研究的利器，了解掌握各类 PCR 的特点、操作步骤及常见问题的原因，有助于提高实验成功率，为科研提供可靠数据支持。