不得不知道的Western blot内参知识

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免疫印迹（Western blot, WB）是分子生物学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一。WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，通常选择在所有组织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参（Loading control）。
内参与其上样量应该如何确定？哪种内参最靠谱？
常用内参抗体分子量及其定位情况如下：


文献报道总蛋白上样量超过10 μg时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异：


所以一般情况下内参的理想上样量为大约5μg。对于目标蛋白的上样量，其理想的上样量为为10-20μg：


GAPDH是一种定位于细胞质的常用内参，使用HeLa细胞裂解液上样10-50μg，结果发现不同上样量GAPDH几乎无变化：


为了测试上述发现是否为普遍现象，将HzAm1细胞裂解液（覆盖了WB分析中的大部分蛋白质）上样4-40μg，PVDF膜ECL显色结果惊奇的发现上样总蛋白质超过4μg时β-Actin条带无明显增加：


为了达到数据标准化的目的，现在诸多SCI期刊审稿人要求每个目标蛋白条带同一张膜上均需孵育内参。然而，从上述β-Actin与GAPDH的结果来看我们有理由怀疑这一要求的合理性！
因此我们使用抗TCTP（翻译控制的肿瘤蛋白）抗体和抗GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）抗体用于评估这一广泛接受的做法。结果显示TCTP与GSK-3β信号强度随着上样量增加几乎成线性关系，而此时β-Actin随着上样量增加几乎无变化：


因此，上述结果说明使用β-Actin重新探测相同的膜以达到数据标准化的目的的传统做法应该受到质疑。那么为什么会出现上述现象呢？
这种现象可归因于β-Actin的丰度，β-Actin丰度远远高于细胞中的大多数其他蛋白质。结果导致β-Actin经常超载，特别是在检测低丰度蛋白质时无法区分蛋白质上样量的差异。为了确认β-Actin的适用范围，在低于4μg的范围内连续稀释样品进行分析（方形折线为理论含量，圆形折线为实际检测情况）：


结果显示在在0.7-1.9μg范围内，β-Actin的条带强度逐渐增加，这与蛋白质上样量非常匹配。在2.2-40μg的总蛋白范围内没有观察到β-Actin明显的条带强度变化，以上结果说明随着上样量在该范围内的增加，实际值和理论值之间的差异变得越来越显著。例如，当总蛋白上样量增加到40μg时，其差异超过10倍。
针对上述问题有人提出了一些解决方法，例如使用丽春红染色（Ponceau staining）或考马斯亮蓝染色（Coomassie staining）替代β-Actin进行数据标准化。当然也有文献这么做，例如：




丽春红染色和考马斯亮蓝染色作为内参的优点是不依赖于单个蛋白质作为内参，因此消除了特定条件下单个管家蛋白的变化的影响。
然而这些方法仍然存在许多问题，丽春红染色总蛋白的光密度值近似线性高达140μg，马斯亮蓝染色高达20μg，然而，实际蛋白上样量远高于理论值，这将缩小甚至减小样品之间蛋白质水平的倍数变化。
此外，由于丽春红染色强度的高度时间依赖性染色和考马斯亮蓝染色的硝化纤维素膜上的高背景，复现性差也降低了它们作为内参的吸引力。


Stain-free总蛋白定量是一种新兴的总蛋白归一化方法，该方法通过直接对每一条泳道的所有蛋白质进行定量避免了各种内参的局限性。与丽春红染色和考马斯亮蓝染色相比，Stain-free总蛋白定量结果更接近理论值，因此强烈推荐此方法！
在此我们使用Stain-free总蛋白定量方法来定量大鼠心脏匀浆中的总蛋白，结果表明Stain-free总蛋白定量准确反映了每个通道中的蛋白质量，可作为WB的可靠内参：


上图Stain-Free™免染胶购自Bio-Rad公司，有兴趣的朋友可以自行查找。接下来对WB检测到的蛋白酶体亚基Rpt1的进行归一化，归一化后Rpt1无变化：


肝脏裂解物(10-45μg) Stain free gel使用紫外活化2分钟后与丽春红S染色液相比Stain free法定量更加准确：




值得注意的是Stain free转膜后的NC膜成像时必须在湿润条件下进行，否则获得的图像质量明显较差：




综上所述，内参抗体在线性范围内才能够很好的反应蛋白上样量，因此上样量无论对于内参还是目标蛋白均很重要。Stain-free总蛋白定量方法由于其准确性与便捷性，可作为我们WB内参定量的金标准！希望今天的分享对大家有所帮助，谢谢大家！

参考文献：
1. Chen, W. & Xu, W. H. β-Actin as a loading control: Less than 2 μg of total protein should be loaded. Electrophoresis 36, 2046–2049 (2015).
2. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics 17, (2017).
3. Gilda J.E., Gomes A.V. (2015) Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization Control: Stain-Free Technology. In: Posch A. (eds) Proteomic Profiling. Methods in Molecular Biology, vol 1295. Humana Press, New York, NY.
4. Gilda, J. E. & Gomes, A. V. Stain-Free total protein staining is a superior loading control to b-actin for Western blots. Analytical Biochemistry 440, 186–188 (2013).

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