手把手带你做western blot——超全攻略

乔帮主

Western Blot即蛋白免疫印迹，行话常常将其称为WB,是将细胞或组织总蛋白质通过电泳从凝胶转移到固相支持物NC膜（硝酸纤维素薄膜）或PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的技术。

该技术中被检测的特定抗原指目的蛋白。特异性抗体指一抗和二抗（二抗是指一抗的抗体，如一抗是从兔中获得的，则二抗就是抗兔 IgG 的抗体，两者可特异性结合）。
使用“一抗”作为“探针”， 标记的二抗用来“显色”。转移蛋白质后的 NC 膜或PVDF膜就称为一个印迹（因为NC膜价格最便宜，使用人数众多，后续均以NC 膜为例）。将印迹用蛋白溶液如 5%BSA（Bovine Serum Albumin  牛血清白蛋白）或 脱脂奶粉溶液或者从公司购买的封闭液处理，封闭 NC 膜上的疏水结合位点。
再用目标蛋白的抗体（一抗）处理 NC 膜——只有目的蛋白才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗掉未结合的一抗后，仅在目的蛋白的位置上结合着一抗。将一抗处理过的 NC 膜用标记的二抗处理，。处理后，带有标记的二抗与一抗特异性结合，可以指示一抗和目的蛋白结合的位置。

WB技术现已广泛应用于蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个研究领域。
对于新手朋友来说可能听说过这一技术，但是不知怎么去做。今天，我们就来介绍一下WB的操作。注意，因各个实验室条件不同，本文仅供参考，请根据所在实验室和课题组确定适宜的操作步骤。

我们的操作按以下几步介绍1.样品中蛋白提取及蛋白浓度测定（含三类样品和两种蛋白浓度测定方法）2.配胶上样及电泳； 3.转膜 ；4.封闭 ；5.一抗孵育 ；6.二抗孵育 ；7.显色曝光(两种方式)。

1. 收集蛋白样品(Proteinsample preparation)
1.1、单层贴壁细胞总蛋白的提取：
（1）倒掉细胞培养瓶中的培养液，尽量倒干净，可用移液枪轻轻吸走残余培养液，操作时间宜迅速
（2）每瓶细胞加3ml-4ml 4℃预冷的PBS（磷酸缓冲盐溶液）（0.01M pH7.2～7.3）。平放“十字”轻轻摇动1min洗涤，弃去洗涤液，重复三次。PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（苯甲基磺酰氟）（100mM），摇匀置于冰上，PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要反复摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作迅速），然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中（全程宜在冰上操作）。
（6）将离心管于4℃下12000rpm离心5min（提前预冷离心机）。
（7）将离心后的上清液分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃冰箱保存。
以上步骤可简单概述为：收集细胞、裂解细胞、离心取上清、保存

注意：不同公司裂解液可能有不同的使用方法（3）（4）步骤请根据实际购买裂解液说明书操作。1M指1mol/L

1.2、组织中总蛋白的提取：
（1）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。（下图为匀浆器）

（2）加400 μL单去污剂裂解液（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
（3）数分钟后再研磨一会儿并置于冰上，要多次研磨使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min（离心机请提前预冷），取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃冰箱保存。

注意：不同公司组织裂解液可能有不同裂解方法，请根据实际情况选择。

1.3、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，部分细胞会脱落下来，所以除按上述1操作外还应收集培养液中的细胞。培养液中细胞总蛋白按下列方法提取：
（1）将培养液转移至15ml离心管中，于2500rpm离心5min
（2）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，2500rpm离心5min。弃上清后用PBS再次洗涤一次。
（3）用移液枪吸干上清后，加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹动以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃12000rpm离心5min（离心机要提前预冷），取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃冰箱保存。
1.4 、蛋白浓度测定：
   收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。这里介绍两种常见的测定方法
一、folin—酚试剂法：
folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。此法可检测的最低蛋白质量达5 mg。通常测定范围是20~250 mg。具体试剂配制见配方1
操作方法:
Ⅰ标准曲线的测定

（1）取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度250mg/ml）。

（2）用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。

（3）再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

（4）这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700 nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，可预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

Ⅱ样品的测定
（1）取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

（2）根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

二、考马斯亮蓝法:
Ⅰ、制作标准曲线
（1 ）从－20℃取出1mg/ml BSA（牛血清白蛋白），室温融化后，备用。
取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。

（2）混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。

Ⅱ、检测样品蛋白含量
（1）取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
（2 ）取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3 ）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5mL），再用无菌水洗一次。
（4） 取一管考马斯亮蓝加95ml0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：考马斯亮蓝使用比较普遍

2. 电泳(Electrophoresis)
2.1配胶
(1) 清洗玻璃板，组装电泳槽，即将玻璃板对齐后用夹卡紧。然后垂直放在架子上准备灌胶

（2）配分离胶（分子量越大，胶浓度越小），大致可参考下表

根据蛋白分子量大小选择不同浓度的胶，先加入ddH2O(双蒸水),之后每加一种成分都要搅拌均匀。AP（过硫酸铵）、TEMED（四甲基乙二胺）最后加。此处以12%分离胶15ml为例，参见配方2

(3)   配好分离胶后，进行灌胶。用10ml移液枪吸取5ml胶沿玻璃注入，待胶面升到绿带中间线高度时即可。用移液枪或注射针垂直于玻璃板水平移动加入ddH2O(或异丙醇)，使得胶平整，凝固加快。

（4）配制4%的浓缩胶,参见配方3
待到板内胶凝固，倒掉上层液体，适当倾斜装置，用滤纸吸干多余水分。灌入浓缩胶，水平插入梳子（注意不要有气泡），等到胶凝固，约半个小时。将内槽从制胶器上解下装入外槽，加好上腔液和下腔液（电泳缓冲液）然后轻轻向上拔出梳子（最好在加入电泳液后再拔梳子，不要干拔）。
(5)  测定好蛋白含量的蛋白上清液以最低蛋白浓度的样品为参照，将所有样品蛋白浓度调到一致（有的实验室用裂解液调浓度，有的用buffer调浓度，有的用其他试剂来调浓度。根据自身实际情况选择），按照上样缓冲液说明书加入一定量的上样缓冲液（缓冲液中一般含指示剂，如溴酚兰），沸水浴或者加热到98℃-100℃处理5分钟使蛋白变性。待冷却后可以准备上样。

注意：上样缓冲液一般有2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。如果最低浓度过小，我们可以选择5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。另外，水浴或者加热后有的实验室会进行离心操作，按实际情况选择

2.2上样：
（1）先上Marker(4ul-5ul)根据说明书选择量的大小（Marker的作用是显示不同分子量蛋白的位置），然后按顺序加样品到后续孔中，样品量一般10-15ul,不能超过20ul.

（2）盖好电泳仪盖子，连接电源，注意正负极不要接反了。恒压80V，当样品到下层胶后换成120V.溴酚兰指示剂到分离胶底部（距底部1CM左右）时停止电泳。

3.转膜：
以前转膜通常都要切胶，切下我们目的蛋白位置的胶，其他的丢弃。现在逐渐推广整块胶来转膜（当然，真正这么做的实验室还不是很多）。

3.1切胶
  我们介绍下切胶的操作，首先，计算好要切的胶的长度和宽度，剪下相同长宽的NC膜。然后准备滤纸，滤纸要比NC膜长和宽大一点，浸泡于转膜液中，可以用中性笔在NC膜的左上角做一个标记，镊子夹取尽量夹边缘。结合Maker位置，根据目的蛋白分子量大小，切下合适大小的胶，泡在转膜液中。

3.2制作“三明治”
  在加有电转液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将转膜的夹子打开，注意要正确放置，一般带有颜色的是让黑的一面保持水平（根据实验室器材实际情况正确使用），垫上一张专用泡沫垫，用玻璃棒来回擀，去除气泡。按下列顺序装配

3.3 开始转膜
  把制作好的“三明治”用夹子夹好，装入转膜仪中。红色（白色）对红色，黑色对黑色，因为电转过程中会有热量产生，注意在转膜仪周围加入碎冰和水来降温。一般用恒流电（如100mA或350mA,根据实验室转膜仪规格选择相应电流）。转移结束后，取出NC膜

3.4丽春红染色
  将转好后的膜用丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用双蒸水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。注意：丽春红染色主要是观察蛋白转膜成功没有，丽春红染色是可逆的，可以用适当溶液冲洗掉（如PBS溶液）

4.封闭
  将膜用TBS（TRIS-HCL缓冲液）从下向上浸湿后，移至含有封闭液的容器中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。然后将NC膜从封闭液取出，用TBS洗膜两次（也可以不用TBS洗涤，用吸水滤纸吸干残留液即可）

注意：封闭液可以向试剂公司购买，当然也可以用脱脂奶粉配成封闭液（在TBST溶液（TBS加吐温-20）加入5%脱脂奶粉）进行封闭

5.孵育一抗：
  5.1孵育
  准备好抗体，用TBST按需求稀释好抗体（如抗体原液和TBST比例为1:500），将稀释好的一抗和NC膜一起孵育，每条膜加入2ml左右稀释后的抗体，4℃过夜

注意：为节省成本，一抗可以回收使用，直至无法孵出抗体

5.2洗涤：
  将膜从一抗液中取出，放入新鲜的TBST溶液（每条膜加2ml）,在摇床上快速摇动5min，共重复洗涤五次（或者共洗3次，每次10分钟）。

6.孵育二抗：
  二抗和TBST比例常见的有1:1000和1:5000，按照需要稀释。将膜放入二抗孵育1小时（有的实验室也孵育2小时，根据实际情况选择）

注意:二抗常常偶联碱性磷酸酶，二抗来源应和一抗相匹配，即可特异性结合
洗涤：将膜从二抗中取出，放入新鲜的TBST溶液（每条膜加2ml）,在摇床上快速摇动5min，共重复洗涤五次（或者共洗3次，每次10分钟）。

7.显色：
包括传统的暗室显色和仪器曝光机两种方式。
7.1暗室显色：
试剂准备参见配方4
（1）将发光液A和B在保鲜膜上1:1混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液（每条膜80-100ul）充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；打开红灯，在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
将曝光好的胶片用扫描仪扫描，用图像处理系统进行灰度值分析

7.2仪器显色曝光：
  现在很多公司推出了western的曝光机，这就让膜分析变得很简单了，只需轻轻点击程序，就能帮助我们完成显色曝光甚至灰度值分析。
配方：
1、folin—酚试剂法配方
试剂准备（1）试剂甲包括（a）和（b）液
（a）10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6-4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。
（b）0.5 g硫酸铜（CuSO4-5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。
（2） 试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100 g钨酸钠（Na2WO4-2H2O），25 g钼酸钠（Na2MOO4-2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150 g硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1 N（H+浓度为1mol/L）左右。
实验中所需标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或 G-球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9% NaCl溶液。
注意：试剂甲和乙配制较为困难，现在有公司提供配好的商品试剂

2、分离胶配方

3、浓缩胶配方

4、显影液、定影液、发光液配方：显影液与水 1:4，定影液与水 1:9，发光液

显影液（5X）： 双蒸水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中） 米吐尔1.55g，亚硫酸钠（无水） 22.5g，碳酸钠（无水）33.75g，溴化钾 20.95g，加入水至 500ml 配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入下一种试剂。配制好后置于4℃保存。使用时， 用蒸馏水稀释至 1 倍。

定影液： 蒸馏水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入，前一种溶解后再加下一种）硫代硫酸钠 240g，亚硫酸钠（无水） 15g，冰乙酸 12.6ml，硼酸7.5g，钾明矾 15g（水温冷至 30℃以下时再加入） 加水定容至 1000ml，室温保存
发光液：鲁米诺试剂 2ml、过氧化氢1.3ml

参考资料：
丁香通https://www.biomart.cn/experiment/80.htm#1001
丁香园http://www.dxy.cn/bbs/thread/17616173#17616173
蛋白质与蛋白质组学论坛http://bbs.antpedia.com/thread-244669-1-1.html
百度文库https://wenku.baidu.com/view/78ca33d86bec0975f465e2d3.html
百度百科https://baike.baidu.com/item/PMSF/9906092?fr=aladdin
百度文库https://wenku.baidu.com/view/0534451c01f69e31433294a4.html
百度百科
https://baike.baidu.com/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/5560390?fromtitle=Western%20Blot&fromid=9884710&fr=aladdin
碧云天官网http://www.beyotime.com/western.htm
维基百科https://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
百度文库
https://wenku.baidu.com/view/4c8d9668590216fc700abb68a98271fe910eaf0e.html
百度文库https://wenku.baidu.com/view/9025e59ed4bbfd0a79563c1ec5da50e2534dd111.html
德泰生物官网http://www.detaibio.com/material-western-blot.html
百度文库https://wenku.baidu.com/view/b6f3a821a5e9856a561260d6.html

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