免疫印迹法在过敏原检测中的临床应用

青草

一、过敏反应和过敏性疾病及其分类       过敏反应又称变态反应，是身体对一种或多种物质的不正常反应，而这些物质对大多数人是无害的。其主要起因是由于变态反应病患者体内产生了过多的一种特殊的抗体，称免疫球蛋白E（IgE）。它可以和环境中的致敏物质（变应原）起反应，刺激机体产生、释放某些过量的化学物质，继而产生各种症状。       过敏性疾病又称变态反应性疾病，是指机体受抗原性物质（也称变应原或过敏原），如花粉、粉尘、食物、药物、寄生虫等刺激后，引起的组织损伤或生理功能紊乱，属于异常的或病理性的免疫反应。2005年世界变态反应组织(WAO)公布了对30个国家进行的过敏性疾病流行病学调查结果: 在这些国家的12亿总人口中,22%(2亿5千万人)患有IgE介导的过敏性疾病。       变态反应性疾病的分类方法很多，根据进入途径的不同可以分为，吸入性变态反应疾病，常见的有过敏性哮喘、变应性鼻炎等；食入性变态反应疾病，如：食物过敏； 接触性变态反应疾病：接触性皮炎、荨麻疹、紫外线过敏等等。按照致敏机体再次接触相应过敏原后出现反应的急缓，又可分为速发型和迟发型两类。1963年Gell和Coombe根据超敏反应发生的机制和临床特点，将其分为四类： ① Ⅰ型变态反应疾病，即IgE介导的超敏反应引起的疾病； ② Ⅱ型变态反应疾病，即细胞溶解型或细胞毒型变态反应性疾病； ③ Ⅲ型变态反应疾病，即免疫复合物型变态反应性疾病； ④ Ⅳ型变态反应疾病，即由迟发型超敏反应引起的疾病。 二、主要的过敏性疾病       2.1 过敏性哮喘       过敏性哮喘占哮喘症的60%，多于儿童期起病，有家族史，常伴有其他特应性过敏症，30%左右可进入成年期，但引起死亡者少见。在引发哮喘的外来过敏原中，国内外均证实尘螨是最多见的。尘螨及其代谢物的数量，自8月份起上升，至9—11月份为高峰，因此某些遗传过敏体质的婴儿，如果出生在秋季，由于此时室内螨类繁殖兴盛，过敏抗原较多，易致敏而诱发哮喘。在国内，过敏性哮喘中80%是由于尘螨引起。过敏性哮喘的机制属于Ⅰ型超敏反应。过敏性哮喘反复发作严重影响人们的生长发育、生活、学习，应特别予以重视。       2.2 变应性鼻炎       变应性鼻炎同样多是由于尘螨引起。变应性鼻炎分为轻度和中重度两种程度。轻度变应性鼻炎对患者生活并无大的影响，而中重度则已经干扰患者生活，导致生活质量下降，工作效率降低、学习成绩下降，影响睡眠、娱乐，患者十分苦恼。常年性变应性鼻炎一年四季都有症状。儿童由于无法表达，经常表现为推鼻子、做鬼脸、青眼窝等。季节性变应性鼻炎症状更加严重，每年固定季节发作，让患者苦不堪言。 如果不及时治疗变应性鼻炎，会造成鼻窦炎、中耳炎、鼻息肉、支气管哮喘等。而且几乎所有的变应性鼻炎患者都患有结膜炎。变应性鼻炎的患者中还有1／3合并患有哮喘表现，在余下2／3没有哮喘的患者中又有2／3患有气道炎症。哮喘患者中合并患有变应性鼻炎的患者有70％——80％。       2.3 荨麻疹       荨麻疹是一种常见的过敏性皮肤病，在接触过敏原的时候，会在身体不特定的部位，冒出一块块形状、大小不一的红色斑块，这些产生斑块的部位，会发生发痒的情形.荨麻疹可以分为急性和慢性，急性荨麻疹为暂时性的过敏反应，只要依照医师指示治疗，大多可在数日内痊愈。而慢性荨麻疹则持续反复的发作数月至数年，体质也会因此变得极为敏感。 三、引起过敏性疾病的因素       3.1、参与的细胞：人体内有两类细胞即肥大细胞和嗜碱粒细胞，它们广泛分布于鼻粘膜、支气管粘膜、肠胃粘膜以及皮肤下层结缔组织中的微血管周围和内脏器官的包膜中。这两类细胞中含有组胺、白三烯、5-羟色胺、激汰等过敏介质。过敏体质的人免疫力普遍比较低下，在化学物质、空气污染、阳光幅照、幅射、细菌、病毒、寄生虫、食物脂肪等环境因子刺激下机体内会产生大量自由基，自由基氧化、破坏肥大细胞和嗜碱粒细胞的细胞膜，使细胞膜变性并诱发合成免疫球蛋白IgE抗体附着在细胞膜上，从而导致细胞不稳定。当不稳定细胞遇到过敏原后，抗原和抗体发生特异反应，导致细胞膜脱颗粒，释放出过敏介质。这些过敏介质可引起平滑肌收缩，毛细血管扩张、通透性增强，粘液分泌，血压降低及组织损伤，从而引发过敏反应的发生。在过敏反应的发生过程中，过敏介质起着直接的作用，过敏原是过敏病症发生的必要条件，而机体免疫能力低下，大量自由基对肥大细胞和嗜碱粒细胞的氧化破坏是过敏发生的根源。       3.2、过敏原： 能引起过敏症的物质数以千计，它们存在的空气、食物、饮料、药物、甚至可接触到的日用品中，而这些物质便叫做“过敏原”。简单来说，过敏原可依据它们怎样进入人体而分为 ①饮食性过敏原：如海产类、果仁类、草莓类、香料、牛奶、啤酒或含有酒精的饮料均可能成为引起最常有的皮肤过敏症状------荨麻疹； ②接触性过敏原：如香水、指甲油、化妆品及橡胶。 ③吸入性过敏原：花粉、尘螨、霉菌和藻类、动物皮毛、工业污染废料以及在潮湿环境中生长的霉菌。 ④注入性过敏原：除了某些注射药物外，还包括昆虫叮咬、大黄蜂和蜜蜂等的刺蛰。 四、变态反应性疾病的特异性诊断       变态反应病的诊断包括非特异性诊断与特异性诊断, 前者系指对一般变态反应疾病作出临床通用的病名诊断； 而后者指病因诊断, 要求查清具体致病物质即过敏原, 对指导病人预防和治疗具有重要意义。特异性诊断又分为体内特异性诊断和体外特异性诊断。       体内特异性诊断的原理：当外源性抗原与过敏病人皮肤内致敏的肥大细胞或淋巴细胞作用, 前者释放组胺或其他胺类物质, 而后者释放淋巴因子, 这些物质可导致皮肤产生反应, 使皮肤血管充血、水肿、渗出,形成红斑、丘疹或风团等改变, 此即特异性皮肤试验阳性。在临床上常规体内特异性诊断方法首推皮肤试验。       体外特异性诊断的原理：变态反应疾病患者的血清中含有针对其致敏变应原的特异的IgE抗体，即特异性IgE抗体（sIgE）。sIgE检测是变态反应疾病的特异性诊断中最重要的检测方法之一。目前临床上sIgE的检测方法很多，包括ELISA、免疫印迹法、荧光酶联免疫法等。       sIgE检测与皮肤试验互为补充，不能相互替代，二者均为变态反应疾病特异性诊断的重要手段。 五、免疫印迹法在过敏原检测中的临床应用       免疫印迹法检测原理：高质量的过敏原蛋白包被硝酸纤维素膜，当含有过敏原特异性IgE抗体的样品加入到反应板内时，IgE抗体与膜上固定的过敏原蛋白相结合，从而形成IgE抗体-过敏原蛋白的免疫复合物固定在膜上，其余没有结合上去的物质则通过洗涤的步骤而被除去。然后加入生物素标记抗人IgE抗体到反应板内，形成过敏原蛋白-IgE抗体-标记生物素的抗人IgE抗体免疫复合物，洗涤除去未结合的物质。在第三步反应中，链霉亲和素标记碱性磷酸酶加入到反应板内，形成了新的免疫复合物：过敏原蛋白-IgE抗体-生物素标记抗人IgE抗体-链霉亲和素标记碱性磷酸酶。通过洗涤除去未结合的物质后加入底物进行显色反应。在酶的催化作用下，无色或淡黄色的底物逐渐变为紫色。颜色强度代表了标本中所含过敏原特异性IgE抗体浓度。用比色卡进行判读，判断显色强度及对应的浓度。一份血清标本可同时测定20余种slgE，包括总lgE的检测，半定量表示结果。 操作简单、方便、成本低， 2.5小时完成全部实验。采用免疫学检测技术---免疫印迹技术，抗原非共价吸附于硝化纤维素膜，可靠性高，特异性好，敏感度高。 融合了生物素-链霉亲和素放大技术，这一免疫酶技术中的放大系统，大大地提高了反应的敏感度和特异性，可以进行极微量的抗原检测，灵敏快速，结果高度准确可靠。 六、讨论       免疫印迹法是目前在临床上使用较多。但目前临床上使用的印迹法检测系统多为外国进口, 价格较贵, 而且与我国同类过敏原抗原决定簇不一致, 不符合我国人群的过敏原谱, 检测患者对其不可能接触到的过敏原的敏感性, 不仅无益于指导临床,还会增加患者负担, 值得临床考虑。ELISA 也是近年来在临床上使用较多的方法, 而且已多为国产试剂。该方法采用生物素- 抗生物素蛋白的放大, 提高了检出特异性IgE 的敏感性,且操作简单, 成本低廉。但该方法容易受交叉反应影响而导致检测结果呈假阳性。       就目前变应原临床运用来看，开发适合我国人群的过敏原谱的免疫印迹法检测系统是势在必行。全部抗原来自国内, 更适合中国人的过敏原检测。