碱基编辑器到底是个什么“神器”，为什么所有人都想用它？

千姿百态

作者/编辑：黄潮勇——北京理工大学生命学院博士生 (微信公众号: My BioWorld)
导读：说起基因编辑领域的华人科学家，除了张锋以外，我首先能想到的就是David Liu，而在他众多的天才发明中，我最膜拜的就是碱基编辑器了。如果说CRISPR是基因编辑的皇冠，那么碱基编辑器就是皇冠上的明珠。2017年，David Liu入选“Nature年度十大人物”，而他开发的单碱基编辑技术也被评为“Science年度十大突破”。那么今天，我就给大家讲讲David Liu的碱基编辑器。
<hr/>如何精准、高效地对基因组进行修饰是生命科学领域研究的重要目标，而CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成为实现该目标的最强工具。传统的CRISPR/Cas9技术通过在靶点处产生DNA双链断裂(DSB)，从而诱发细胞内的同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)修复途径，进而实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等修饰。然而，DSB引发的DNA修复很难实现高效稳定的单碱基突变。
单核苷酸变异会导致大约2/3人类遗传病的发生，也是许多动植物重要性状变异的遗传基础，因此开发一种精准且能够高效实现单碱基替换的技术尤为重要，David Liu实验室开发的碱基编辑器就是为此而生的。David Liu实验室开发了三种不同的碱基编辑器，分别是胞嘧啶碱基编辑器(CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(ABE)和先导编辑器(Prime Editor)，这些碱基编辑器在工作时不依赖DSB的产生，也不需要供体DNA的参与。
那么接下来就让我来简单介绍一下这三种碱基编辑器
<hr/>1、胞嘧啶碱基编辑器



【图1】CBE的工作原理

CBE的核心组成元件是nCas9或dCas9和胞嘧啶脱氨酶，Cas9蛋白与胞嘧啶脱氨酶组成融合蛋白 [1]。具体工作原理：当融合蛋白在sgRNA的引导下靶向基因组DNA时，胞嘧啶脱氨酶可结合到由Cas9蛋白、sgRNA及基因组DNA形成的R-loop区的ssDNA处，将该ssDNA上一定范围内的胞嘧啶(C)脱氨变成尿嘧啶(U)，进而通过DNA复制或修复将U转变为胸腺嘧啶(T)，最终实现C•G碱基对至T•A碱基对的直接替换。



【图2】CBE的升级

第一代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-dCas9
第一代胞嘧啶碱基编辑器BE1由rAPOBEC1(大鼠胞嘧啶脱氨酶)和完全失去切割活性的dCas9组成 [1]，可以在体外实现有效的碱基编辑(25%~40%)，但在哺乳动物细胞内的编辑效率大大下降(0.8%~7.7%)。主要原因是细胞内存在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，UDG可识别U•G错配，并切割尿嘧啶和磷酸骨架之间的糖苷键，通过细胞内的碱基切除修复途径(BER)将U逆转为C。
第二代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI
为了抑制UDG的作用，David Liu实验室在BE1的基础上融合了来自噬菌体PBS的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)，开发了第二代胞嘧啶碱基编辑器BE2 [1]。UGI能够抑制人类和细菌中UDG的作用，提高编辑效率，经测试BE2的编辑效率比BE1提高了3倍。
第三代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI
为了进一步提高编辑效率，David Liu实验室结合细胞的内源修复机制开发了第三代碱基编辑器BE3 [1]。BE3将BE2中的dCas9替换为nCas9(D10A)，可特异性地在非编辑链上产生一个缺口，进而刺激细胞内的碱基错配修复途径(MMR)，以含有U的编辑链作为模板进行修复，从而增加编辑效率。BE3的编辑效率比BE2提高了2~6倍，平均约为37%，该碱基编辑器是目前较为广泛使用的CBE版本。
第三代胞嘧啶碱基编辑器的不同子版本
BE3编辑的活性窗口可覆盖sgRNA的第4~8位，依据不同的研究目的需要对编辑活性窗口做相应的改变。当需要精准地改变某个特定的碱基C时，过大的活性窗口会导致窗口内非靶标碱基C的编辑。David Liu实验室在BE3的基础上，通过突变胞嘧啶脱氨酶上与DNA作用的关键活性位点，开发了YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3和YEE-BE3，从而将编辑活性窗口由5nt缩小至1~2nt，但同时对靶标C的编辑效率有所降低 [2]。
第四代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI



【图3】BE3编辑产生不同的产物

BE3编辑后依旧会产生不同的产物，主要表现为两个方面: (1) BE3除了将C转换为T之外，也有一定几率将C转换为G或A [1]。这是由于UDG可将U切除形成无嘧啶位点(AP)，经过跨损伤合成(TLS)聚合酶作用及DNA复制等，也有一定几率将C转换为其他碱基。(2) 在编辑过程中会产生少量的Indels [1]，这是由于形成的AP位点会在AP裂解酶或自发裂解下产生一个缺口，进而与nCas9在非编辑链产生的缺口刚好形成一个DSB，经过NHEJ修复途径后产生Indels产物。
为了减少不必要的编辑产物，David Liu实验室在BE3的基础上融合了第二个拷贝的UGI，增强对UDG的抑制作用，构建了第四代胞嘧啶碱基编辑器BE4 [3]。与BE3相比，BE4不仅提高了碱基编辑效率，并且C至A或G的转换频率降低了2.3倍。
第四代胞嘧啶碱基编辑器的不同子版本
为了降低Indels的发生，David Liu实验室在BE4的基础上融合了来源于噬菌体Mu的Gam蛋白，构建了BE4-Gam [3]。Gam蛋白可结合于DSB的末端防止其降解，进而阻止了NHEJ修复途径的发生。
细胞内胞嘧啶碱基编辑器的表达水平是影响其编辑效率的重要因素，David Liu实验室在BE4的基础上通过增加不同数量的核定位信号(NLS)以及使用不同公司优化的密码子序列等方法构建了BE4max和AncBE4max，这两种胞嘧啶碱基编辑器可在各种哺乳动物细胞内进行高效的编辑。
<hr/>2、腺嘌呤碱基编辑器



【图4】ABE的工作原理

ABE的核心组成元件是nCas9(D10A)和人工定向进化的腺嘌呤脱氨酶，Cas9与腺嘌呤脱氨酶组成融合蛋白 [5]。ABE的作用原理与CBE类似，即当融合蛋白在sgRNA的引导下靶向基因组DNA时，腺嘌呤脱氨酶可结合到ssDNA上，将一定范围内的腺嘌呤(A)脱氨变成肌苷(I)，I在DNA水平会被当做G进行读码与复制，最终实现A•T碱基对至G•C碱基对的直接替换。ABE的开发打破了CBE仅能编辑C或G的限制，为碱基之间的相互转变提供了更多的可能性。相比CBE，ABE不需要抑制烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)的活性。
腺嘌呤脱氨酶的改造



【图5】定向进化改造腺嘌呤脱氨酶

由于目前已知的腺嘌呤脱氨酶不能以DNA为底物对碱基A进行脱氨，因此必须对现有的腺嘌呤脱氨酶进行定向改造，这导致ABE的开发比CBE更具有挑战性。David Liu实验室选取大肠杆菌的腺嘌呤脱氨酶TadA为改造对象，将随机突变的TadA融合dCas9构建随机突变库，通过ABE恢复氯霉素、卡那霉素、壮观霉素等抗性基因的功能，结合易错PCR、DNA重排等定向进化策略，进行相应的抗生素筛选，先后经过7轮进化与改造后，成功筛选到了能直接作用于ssDNA的腺嘌呤脱氨酶，在人类细胞中建立了目前效率最高且应用最广的ABE版本ABE7.10(ecTadA-ecTadA*-nCas9) [5]。
ABE7.10将nCas9与野生型腺嘌呤脱氨酶ecTadA和经过定向进化的腺嘌呤脱氨酶ecTadA*二聚体融合，在人类细胞中编辑效率约为50%，编辑活性窗口可覆盖sgRNA的第4~9位。
腺嘌呤碱基编辑器的升级
无论在哺乳动物还是植物等生物中，ABE7.10均可保证高精度的碱基替换和较少的Indels发生，因此对ABE7.10的优化主要表现在提高编辑效率、扩大编辑活性窗口和扩大编辑范围。
David Liu实验室在ABE7.10的基础上通过融合不同数量的NLS以及使用不同公司优化的密码子序列构建了ABEmax，提高了对碱基A的替换效率[6]。随后，David Liu实验室对ABEmax进行改造，构建了CP1012-ABEmax、CP1028-ABEmax、CP1041-ABEmax和CP1249-ABEmax，这些版本的编辑器在保证编辑效率与ABEmax相当的同时，在一定程度上将4~9位的编辑活性窗口拓展为4~12位[7]。
<hr/>3、先导编辑器
CBE和ABE组合使用可以有效地进行4种碱基转换(C→T, G→A, A→G, T→C)，而无需产生DSB，然而除了这4种碱基转换，对另外8种碱基转换(C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G)以及碱基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。
为了解决这个问题，David Liu实验室开发出先导编辑器(Prime Editor, PE)，PE在不依赖DSB和供体DNA的条件下便可有效实现所有12种碱基转换，此外还能有效实现多碱基的精准插入(最多可插入44bp)和删除(最多删除80bp) [8]。



【图6】PE的组成

PE以CRISPR/Cas9系统为基础，在两方面加以改造。首先是改造sgRNA，在其3&#39;末端增加一段RNA序列，获得的RNA被称作pegRNA；其次是将nCas9(H840A)与逆转录酶融合，获得新的融合蛋白 [8]。pegRNA上新增加的RNA序列有双重角色，一段序列作为引物结合位点(PBS)，与断裂的靶DNA链3&#39;末端互补以起始逆转录过程，另一段序列作为逆转录模板，携带了目标点突变或插入缺失突变以实现精准的基因编辑。



【图7】PE的工作原理

PE的工作原理如图7所示，首先是在pegRNA的引导下，nCas9切断含PAM的靶DNA链，断裂的靶DNA链与pegRNA的3’末端PBS序列互补并结合，之后逆转录酶发挥功能，沿逆转录模板序列开始逆转录反应。反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡中的5’flap和3’flap结构，其中3’flap结构的DNA链携带有目标突变，而5’flap结构的DNA链则无任何突变。细胞内5’flap结构易被结构特异性内切酶识别并切除，之后经DNA连接和修复便实现了精准的基因编辑 [8]。
先导编辑器的升级



【图8】PE的升级

David Liu实验室首先将野生型的鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶与nCas9融合，构建出第一代先导编辑器PE1。PE1在293T细胞中的点突变效率为0.7~5.5%, 碱基插入/删除的效率为4~17% [8]。随后他们通过优化M-MLV逆转录酶得到第二代先导编辑器PE2，其碱基突变和插入/删除的效率较PE1有两倍以上的提高 [8]。
PE1/2系统只编辑双链DNA的一条链，另一条非编辑链需进一步的DNA修复以完成精准编辑。理论上，通过nCas9切断非编辑链可以有效提高该链的修复效率，为此David Liu实验室在PE2的基础上，增加可切断非编辑链的sgRNA，获得PE3和PE3b []。PE3和PE3b的编辑效率较PE2提升了将近3倍，在293T细胞中的最高编辑效率可达78%。当然，由于使用了两条sgRNA，PE3和PE3b的引入Indels的风险也随之提高，这是PE3未来需要加以改进的不足之处。
Nature杂志评论这一技术是“超精确的新型基因编辑工具”；Science杂志评论它是“超越CRISPR”的重大突破”；哈佛大学教授，CRISPR先驱George Church盛赞这一成果“朝着正确方向迈出的一大步”。
<hr/>结语：像David Liu这种大神级别的人物，我除了膜拜还是膜拜，如果你去查他们实验室这几年发的文章，你就会发现，他们发CNS及其子刊的频率是以天或周来计算的，而我们发SCI也只能用月甚至年来计算。我对David Liu的编辑编辑器是很钟爱的，很多文章我都仔细看了，也一直想在实验室建立这一套系统，然而我发现每次我还没来得及设计实验方案，他们的系统又升级了！对于这一点，我真的是无Fuck说！

参考文献
[1] Nature(2016) 533:420-424
[2] Nat Biotechnol(2017) 35:371-376
[3] Sci Adv(2017) 3:eaao4774
[4] Nat Biotechnol(2018) 36:843-846
[5] Nature(2017) 551:464-471
[6] Nat Biotechnol(2018) 36:843-846
[7] Nat Biotechnol(2019) 37:626-631
[8] Nat Biotechnol(2020) 38:620-628

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/141987848