用什么实验可以验证蛋白与蛋白相互作用,如何进行?

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用什么实验可以验证蛋白与蛋白相互作用,如何进行?
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科研服务_安徽中科圣安生物技术有限公司荧光素酶互补成像技术原理简介
  萤火虫荧光素酶片段互补成像技术（LCI）是近年来形成的研究蛋白互作的新技术，把2个目标蛋白分别连接于萤火虫荧光素酶的C端 （CLuc：398–550 aa)和N端（NLuc：2–416aa）。如果2个蛋白互作，N段和C端接近形成有活性的荧光素酶，荧光素酶分解萤光素底物并产生荧光。
  将LCI技术与烟草瞬时表达技术相结合来研究植物蛋白的相互作用。该技术具有很多优势：1、可以实现活体细胞内实时、定量分析；2、不受植物自发荧光的干扰；3、不需要裂解细胞提取蛋白质，可以很好的反映植物生理条件下蛋白的互作状态。



▲ 荧光素酶互补成像（LCI）实验流程图

荧光素酶互补成像技术实验流程
  ①植物表达载体构建（融合蛋白）：目的基因克隆或目的基因合成；限制性内切酶酶切骨架载体并纯化；目的基因插入骨架载体；转化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定；
  ②转化农杆菌：将目的载体转化到农杆菌菌株内，例如：GV3101；
  ③注射烟草：将含有CLuc与NLuc的农杆菌菌液按照比例混匀，共同注射本氏烟叶片；
  ④定量、定性分析；
  ⑤检测目的蛋白的表达；
  ⑥分析结果并完成交付。
荧光素酶互补成像技术结果展示



荧光素酶互补成像

荧光素酶互补成像技术技术服务范畴：验证两个已知蛋白质间的相互作用
荧光素酶互补成像技术技术服务优势：
  ①团队经验丰富；
  ②提供原始图片，保证数据真实可靠；
  ③该技术得到的蛋白互作关系符合体内实际情况，结果可信度高；
  ④可定性、定量分析蛋白互作关系。

大力水手

今天给大家讲一篇2024年西湖大学在AAAI 2024上发表的利用对比学习方法来预测化合物蛋白相互作用的文章。由于现有的深度学习方法只利用蛋白质序列或结构的单一模态进行建模，因此可能在复杂的现实场景中出现如模态缺失和域偏移使得性能显著下降。在本文中，作者提出了一种多尺度蛋白质序列结构对比学习框架（PSC-CPI），它通过模态内和跨模态的对比来捕获蛋白质序列和结构之间的依赖关系。此外，测试数据中化合物与蛋白都不在训练集的情况下依旧有较优的泛化性。因此，该方法的提出将更有助于揭示化合物与蛋白间的结合方式和理解生物学过程，加速新药的研发进程。
化合物蛋白相互作用的研究背景

药物分子通过与人体内特定的蛋白质靶标相互作用，从而实现治疗疾病的效果。图1展示了二肽基肽酶-4（DPP-4)靶点与阿格列汀的分子药物之间的相互作用。化合物-蛋白质相互作用（CPI）的研究对于活性药物发现、药物重定位、发现药物的作用机制等都有深远的意义。预测的主要目的是通过预测CPI的相互作用模式（如接触图）和强度（如结合亲和力）来发现新的药物。然而现有的筛选方法在很大程度上依赖于蛋白质三维结构而且计算非常耗时。此外，大多数深度学习方法在训练集上表现较好，但很难泛化到更真实的测试数据。因此，如何将模型扩展到现实应用场景中仍然是CPI预测的一个重要问题。



图 1 二肽基肽酶-4（DPP-4）蛋白靶点之间的互作方式

设计流程

2.1 PSC-CPI架构部分

PSC-CPI主要分为两个部分，其中化合物编码器旨在从给定的分子图中提取化合物表征。蛋白编码器旨在从给定的蛋白序列和结构中提取蛋白的表征。成对相互作用模式预测用于预测蛋白质残基和化合物原子之间的接触图，并学习化合物-蛋白质联合表示，然后通过预测蛋白质残基与化合物原子之间的接触图来学习化合物-蛋白的成对表征。此外，还引入了相互作用强度预测模块以预测化合物-蛋白结合亲和力（图2）。



图2 PSC-CPI模型设计流程

2.2 多模态对比学习方法

为了使得模型当仅知道蛋白序列或者仅有结构时，也可以很好地提取蛋白的表征，作者提出了一个多尺度序列结构对比学习方法。如图3所示，该方法首先对长度可变的蛋白序列进行数据增强，并进行模态之间的对比学习，以此来充分捕获了序列结构之间的信息。



图3 多模态对比学习方法

实验结果

3.1 多模态缺失下的推理评估

为了评估模型在缺失模态数据的条件下的性能，作者首先使用少量已知的序列-结构对来训练模型，然后在三种不同的推理模式下测试其泛化性。图4可以发现蛋白质序列和结构对于不同的任务有各自的优势，序列的表征更有利于二者结合强度预测，而结构的表征更有助于交互模式的预测。PSC预训练后的分类及回归任务的性能都优于未经过预训练的CPI模型。通过PSC进行预训练，单模态的推理性能甚至超过基于多模态提取特征的方法。此外，在序列及结构都未见过的条件下，预训练方法相较于原本的CPI模型性能有较大幅度提升。



图4 PSC-CPI泛化性能比较

3.2 蛋白长度及原子数对于模型性能的影响

为了评估PSC-CPI与其他基准方法在不同蛋白质长度和原子数量下的性能，作者选择了三种具有代表性的方法（TransformerCPI, PerceiverCPI, Cross-Interaction）进行比较，图5可以看出随着蛋白质长度和原子数量的增加，相较于其他基准方法，PSC-CPI预测性能显著提升，这表明PSC-CPI在处理复杂蛋白质或化合物方面具有更大的优势。



图5 蛋白长度及原子数对于模型性能的影响评估

3.3 消融实验及可视化分析

为了探究不同训练策略对于模型性能的影响，作者分别去掉了模态内的对比、跨模态的对比、采取对序列进行固定长度的增强三种方式进行消融实验分析，如图6所示，当使用模态内、跨模态的对比学习方法时，性能提升更多，这表明序列结构间的依赖是较为重要的。进一步，作者选择了两个化合物蛋白对，并对它们残基位点之间的接触图的标签和其他基准方法的预测结果进行可视化。由图7可知，PerceiverCPI和Cross-Interaction分类性能上优于TransformerCPI，但在定性可视化结果和AUC值上仍远逊色于PSC-CPI。



图6消融实验分析比较



图7 接触图可视化展示

结论

作者提出了一种新的多尺度蛋白质序列结构对比学习方法PSC-CPI用于化合物蛋白互作预测。在缺失蛋白序列或者结构模态时，也可以对下游蛋白相关的数据进行推理。通过引入长度可变的数据增强方式和交叉模态对比学习方法，使得PSC-CPI能够捕获序列结构间的依赖性和多尺度信息。实验表明该方法在处理复杂的蛋白质或化合物方面具有更大的优势。尽管该方法的泛化性相较于其他基准模型有显著优势，但仍有局限性。如多尺度建模只涉及残基-蛋白质层面，未来可将其扩展到蛋白质的原子尺度上的建模。
参考文献

• Hermosilla, P.; and Ropinski, T. 2022. Contrastive representation learning for 3d protein structures. arXiv preprint arXiv:2205.15675.
  

清风寡欲

验证蛋白与蛋白相互作用的实验有许多种方法，下面主要列举了一些常用的实验方法来研究蛋白与蛋白之间的相互作用。
一、免疫共沉淀 (Immunoprecipitation, IP)
免疫共沉淀是一种常用的验证蛋白与蛋白相互作用的实验方法。它基于抗体与特定蛋白结合的原理。将目标蛋白的特异性抗体与待检测蛋白的混合液共孵育，然后用蛋白A/G琼脂糖或其他介质捕获抗体结合的复合物，将复合物洗脱并进行分析。
二、EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
电泳迁移实验是一种通过观察蛋白与DNA/RNA结合产生的复合物的迁移率差异来验证蛋白与蛋白相互作用的方法。该方法将待检测蛋白与一段包含特定结合位点的DNA/RNA序列共孵育，并通过凝胶电泳分离复合物。
三、Co-IP (Co-Immunoprecipitation)
同时免疫共沉淀是一种用于检测蛋白与蛋白直接相互作用的实验方法。该方法通过共孵育多个抗体，实现多个蛋白的复合物同时捕获和分析，从而验证它们之间的相互作用。
四、GST Pull-Down Assay
GST拉下实验是一种常用的蛋白互作实验方法。在该实验中，目标蛋白与融合了GST标签的互作伴侣蛋白共孵育，然后将复合物与GST结合的琼脂糖矩阵一起孵育，通过洗脱、分离和检测等步骤，验证蛋白与蛋白的相互作用。
五、Y2H (Yeast Two-Hybrid)
酵母双杂交是一种广泛应用于蛋白互作研究的实验方法。该方法通过将目标蛋白的DNA序列与激活或提取的酵母转录因子的DNA结合，将这些构建体导入酵母中，观察蛋白与蛋白相互作用所导致的酵母胞内报告系统的活性。
六、FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
荧光共振能量转移是一种基于荧光信号的方法，用于检测蛋白与蛋白相互作用。该方法基于两种荧光蛋白（给体和受体）之间的能量转移，在给体荧光被受体荧光吸收时，能发出荧光信号，从而验证蛋白与蛋白的互作。
七、BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation)
双分子荧光互补是一种通过两个荧光反应蛋白的互补来验证蛋白与蛋白相互作用的方法。将目标蛋白与分别标记有荧光反应片段的互作伴侣融合蛋白一起表达，如果它们相互作用，可以在激活荧光信号后观察到恢复的荧光。
八、SPR (Surface Plasmon Resonance)
表面等离子共振是一种用于检测生物分子相互作用的实验技术。该方法通过将其中一个蛋白固定在芯片表面上，然后流动另一个与其相互作用的蛋白溶液，通过监测光信号的变化来确定它们的互作。
九、质谱法 (Mass Spectrometry)
质谱法通过检测目标蛋白与其他蛋白之间的互作复合物来验证蛋白与蛋白的相互作用。该方法涉及将复合物离解为不同的片段，并使用质谱仪来检测和鉴定这些片段，从而确定蛋白与蛋白的相互作用。
十、X-ray结晶 (X-ray Crystallography)
X射线结晶学是一种用于解析蛋白相互作用的三维结构的实验方法。该方法涉及将相互作用的蛋白进行结晶，然后利用X射线对结晶体进行照射，通过分析X射线的散射模式来确定蛋白与蛋白之间的相互作用。
十一、NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
核磁共振是一种用于研究蛋白相互作用的实验方法。该方法利用蛋白质中含有的核磁共振活性核进行分析，观察核磁共振信号的变化来确定蛋白与蛋白的相互作用。
十二、AFM (Atomic Force Microscopy)
原子力显微镜是一种能够观察蛋白相互作用的实验方法。该方法利用探针探测蛋白复合物的形状、表面和力学特性，通过观察和测量的变化来验证蛋白与蛋白的相互作用。
以上就是是一些常用的验证蛋白与蛋白相互作用的实验方法。具体选择哪种方法取决于研究的具体问题和条件。每种方法都具有其优缺点和适用范围，在实验设计和执行过程中需要谨慎考虑，以确保数据的可靠性和准确性。
希望该条回复对你有帮助，如果有什么疑问也可以私信交流或者回复我。

卡卡

在研究到蛋白与蛋白相互作用的时候，CO-IP和GST-Pull down是两个绕不开的方法。
CO-IP可以分为在目的细胞中的内源性IP和在工具细胞系（一般为293T）的外源性CO-IP。而GST-Pull down作为在原核生物中表达蛋白，和完全脱离了细胞环境。这样的话，只有真正有相互作用的蛋白才能被拉下来。

免疫共沉淀（Co-IP）是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础，用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法。利用免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用，或者利用已知蛋白寻找与之相互作用的未知蛋白



GST-pull down利用了GST对谷胱甘肽（GSH）偶联球珠的亲和性，将GST融合蛋白与谷胱甘肽偶联球珠结合，并从蛋白的混合液中纯化得到与GST融合蛋白相互作用的蛋白。该法可以鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白，也可鉴定两个已知蛋白间是否存在相互作用。
一般实验中通过使用CO-IP和GST-pull down进行双重验证，以证明两种蛋白确实有相互作用。



举个离子，在发表于cell metabolism的文章 Glycogen Synthase Kinase-3α Promotes Fatty Acid Uptake and Lipotoxic Cardiomyopathy. 证明了GSK3α在脂肪酸摄取增多和脂中毒的心肌病中的作用，文章通过CO-IP和GST-pull down来证明糖原合酶激酶-3α（GSK-3α）介导心脏中的脂质积累。脂肪酸（FA）上调GSK-3α，其在配体结合域（LBD）中磷酸化PPARα的Ser280位点。
实验步骤过长，这里就不在叙述了，感兴趣可以自己查看原文看看实验步骤噢~

清风寡欲

免疫共沉淀（Co-IP）：最经典方法，在Co-IP中，使用每种蛋白质特异性抗体从细胞裂解物中免疫沉淀两种怀疑相互作用的蛋白质。如果蛋白质相互作用，它们会相互共沉淀，并且可以通过蛋白质印迹或质谱法检测。
酵母双杂交 （Y2H） 测定：Y2H 测定是一种遗传测定，它依赖于两种相互作用的蛋白质将酵母中转录因子的两个互补部分结合在一起的能力，从而导致报告基因的激活。两种蛋白质之间的相互作用可以通过监测报告基因的表达来检测。
荧光共振能量转移（FRET）：FRET是一种基于显微镜的技术，它依赖于彼此靠近的荧光分子之间的能量转移。在FRET实验中，两种荧光标记的蛋白质在细胞中表达，并通过监测荧光团之间的FRET信号来检测两种蛋白质之间的相互作用。
生物发光共振能量转移（BRET）：BRET类似于FRET，但使用发光蛋白而不是荧光蛋白作为供体。供体蛋白在与受体蛋白相互作用时产生光，可以使用光度计检测。
表面等离子体共振（SPR）：SPR是一种无标记技术，用于测量蛋白质结合时表面折射率的变化。在SPR实验中，一种蛋白质被固定在表面上，并通过监测折射率的变化来检测第二种蛋白质与固定化蛋白质的结合。
Pull-down实验：

• Affinity pull-down assays: In affinity pull-down assays, the bait protein is engineered to contain a specific affinity tag, such as a His-tag or a FLAG-tag, which allows the protein to be selectively immobilized on a support containing a corresponding binding partner, such as nickel or anti-FLAG antibodies.
  
• GST pull-down assays: In GST pull-down assays, the bait protein is fused to glutathione-S-transferase (GST), which can be immobilized on a support containing glutathione beads. The interacting proteins are then identified by western blotting or mass spectrometry.
  

Pull-down实验