核酸的分离提取应注意哪些事项？

Rose

核酸的分离提取应注意哪些事项？
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大力水手

基因作为生物遗传信息的载体，通过基因检测，大众能够发现身体内潜在的疾病风险，及早采取有效的预防或者干扰措施。基因是遗传的基本单元，是产生一条多肽链或功能RNA所必需的DNA片段。可以简单理解为好长一段DNA链中比较特殊某段。
而做好基因研究的第一步就是获取核酸，核酸提取通常是开启生物学研究的第一步，而且提取的核酸质量高低也是决定下游实验成败的关键因素之一。无论后续的克隆、PCR、QPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。
什么是核酸?

核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。
核酸作为基因表达的物质基础，是分子生物学研究的主要对象。无论是进行核酸的结构还是功能研究，首先都需要对核酸进行提取和纯化。核酸提取为大量广泛研究和应用提供了基础。
核酸提取的基本步骤

1、裂解细胞，释放核酸。使用裂解液破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中;
2、核酸的分离与纯化。需要将与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除;
3、核酸的浓缩、沉淀;
4、纯化核酸。纯化则是使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
核酸提取纯化原则和要求

1、需要保证核酸一级结构的完整性，为下游实验做准备;
2、排除其它核酸分子的污染(提取DNA时排除RNA的干扰，反之亦然);
3、核酸样品中没有对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子;
4、将核酸样品中其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低程度。
核酸提取纯化的常见方法

(一)核酸提取按照提取方式可分为手工提取和通量较高的自动化提取。
(二)按照提取原理有如下方法：
煮沸裂解法

此法一般用于DNA的手工提取。染色体DNA比质粒DNA分子大很多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环装分子;当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭合的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象;变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。
煮沸裂解法提取DNA，得量少，杂质多，DNA可能会出现断裂，主要适用于一些粗略的实验。
酚氯仿抽法

此法是DNA提取的经典方法，主要是使用两种不同的有机溶剂交替抽提将蛋白去除。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA的联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，同时苯酚抑制了DNase的降解作用，蛋白质分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。离心后，DNA可取出。
酚氯仿抽提最大的优势是成本低，对实验条件要求较低。提取的DNA保持天然状态。获得的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是操作较为繁琐。
浓盐法

高盐沉淀法是酚氯仿抽提方法的一个变种，利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。优点事省略了酚氯仿抽提操作的麻烦，并且几乎克服了酚氯仿抽提方法的一切缺点，只是得到DNA的纯度不够稳定。
阴离子去污剂法

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，同时阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。
SDS法操作简单、温和，也可提取到较高分子量 DNA ，但所得产物含糖类杂质较多。
异硫氰酸胍/苯酚法(Trizol法)

Trizol法是提取RNA的经典方法，在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时又能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
Trizol法适用于普通的植物组织、动物组织以及真菌和细菌等的RNA提取实验。
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)

CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
离心柱纯化

通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，而RNA和蛋白质顺利通过，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐高PH值洗脱，来分离纯化核酸。离心柱纯化也是试剂盒提取中广泛的使用方法。
离心柱法DNA提取试剂盒价格较低，操作相对简单，在市面上应用较为广泛。但是其具有样本需求量大，损失多，对于珍稀样本无能为力，同时不便于高通量、自动化操作等劣势。
磁珠法提取

磁珠法利用了磁性颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，先使用细胞裂解液裂解细胞，带有活性基团的磁性颗粒可特异性吸附从细胞中游离出来的核酸分子，而样品中的其他干扰物则很好的移除了，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开完成，最后回收颗粒(即磁珠-DNA 混合物)，再用洗脱液洗脱即可得到纯净的DNA，获得质量较高的核酸模板。
磁珠法不需要离心、无需加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求。但是成本较高，科研端使用很难普及。

感恩由您

自20世纪诞生以来，分子生物学迅速发展并在整个生命科学领域广泛渗透和应用，推动了传统医学进入基于分子层面实验科学的现代生物医学时代。

核酸提取和纯化是分子生物学试验的基础，在以下应用实验中都需要进行核酸提取：
● 分析基础研究和疾病研究中的基因表达；
● 跟踪对药物治疗的反应(例如，在抗病毒治疗期间和之后监测病毒滴度）；
● 识别新物种并深入了解进化过程 (例如，Ancient DNA分析）；
● 对人类、动物和植物中引起传染病暴发的病原体进行监测和分类；
● 通过微生物检测和量化监测食品和水安全；
● 诊断疾病 (如基因疾病，癌症，免疫学缺陷）。

核酸提取纯化基本步骤



核酸纯化方法是影响提取核酸质量高低的最重要因素之一，也是下游分子生物学试验成败的关键，遵循提取纯化原则以及选择合适的纯化、浓缩方法，可以使核酸的质量及回收率达到最大化。

核酸提取纯化原则和要求

● 需要保证核酸一级结构的完整性，为下游实验做准备；
● 排除其它核酸分子的污染（提取DNA时排除RNA的干扰，反之亦然）；
● 核酸样品中没有对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子；
● 将核酸样品中其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低程度。

核酸提取纯化的常见方法

溶液抽提法

经典的DNA提取方法：酚氯仿抽法，主要是使用两种不同的有机溶剂交替抽提将蛋白去除。通过苯酚氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后，在水相中主要溶解的是以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是多糖和脂类物质，蛋白质则沉淀于两相之间。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀核酸，之后再离心分离和溶解洗脱，最后通过将洗涤后的核酸沉淀进行浓缩干燥即可得到高纯度核酸。



离心柱法（柱膜法）

通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，而RNA和蛋白质顺利通过。硅胶膜表面的硅醇基团呈弱酸性，其水化后带负电。当溶液中存在一定浓度的阳离子后，形成的阳离子桥能够中和DNA和硅醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA牢固地吸附在硅胶膜表面。反之，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅醇基团与DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放DNA。
利用高盐低PH结合核酸，低盐高PH值洗脱，来分离纯化核酸。离心柱纯化也是试剂盒提取中广泛的使用方法。



磁珠法

运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。磁珠法利用了磁性颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，先使用细胞裂解液裂解细胞，带有活性基团的磁性颗粒可特异性吸附从细胞中游离出来的核酸分子，而样品中的其他干扰物则很好的移除了，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开完成，最后回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱，纯化浓缩后即可得到纯净的DNA，获得质量较高的核酸模板。


提取纯化方法的选择

一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。



如果对核酸提取的质量要求不高，可以选择经济实惠的溶液法，选择柱膜法还是磁珠法自动化提取，基本上取决于样本数量，针对大批量的样本，优选磁珠法自动化提取。如果对样本数量较少，则可以选择柱膜法，既快速又经济实用。对于Oligo寡核苷酸的纯化，实验要求更高。

不管采用哪一种核酸提取纯化方法最后都离不开浓缩干燥！
● 再浓缩核酸样品，随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，甚至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩，可将150uL DNA水溶液浓缩至10uL再进行测序；
● 去除DNA样品中醇的残留，当DNA样品中有乙醇的残留会影响测序反应；
● 干燥DNA样品。DNA沉淀后可能会含水或水/乙醇混合液，浓缩去除后可以得到干燥的DNA样品。

常用的干燥方法：风干VS真空离心浓缩仪应用案例分享

WTCHG（牛津大学人类遗传学威康信托中心) 使用Sequenom MassARRAY®SNP 基因分型系统用于SNP分析，样品前制备过程分别使用风干（左）和Genevac EZ-2真空离心浓缩仪（右）干燥含有寡核苷酸样品的384孔板。
下图结果表明，使用EZ-2真空离心浓缩仪干燥寡核苷酸样品，可以大大降低样品降解率，保证样品不会被污染，消除了样品损坏的潜在来源。



深绿色-高样本数据质量
浅绿色-中等样本数据质量
红色-样品质量差或无数据
使用真空离心浓缩仪，可以避免核酸浓缩干燥遇到的过度加热、绝对干燥、交叉污染及紫外损害保证核酸样品的完整性。



浓缩干燥DNA样本，Genevac真空离心浓缩仪是合适的选择，Genevac系统广泛应用于DNA样品制备与纯化处理，不论是处理PCR前的简单的小体积浓度DNA pellets，还是高通量处理许多纯化DNA或寡核苷酸的样品，都有不同的机型可供选择。


如果你对上述产品或方案感兴趣，欢迎随时联系Tegent德祥。

Genevac

英国Genevac是德祥集团资深合作伙伴之一。英国Genevac公司成立于1990年，隶属SP Scientific旗下，一直专注于研究和生产各种离心蒸发浓缩设备，其产品广泛应用于生命科学、制药、化学、分析等领域。

德祥科技
德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。
30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。
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我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

队长是我

提取完DNA或RNA之后，通常需要测浓度，这也是质检的主要方法。在分光光度计上进行的吸光度测量包括样品中在不同波长处吸收的所有分子的吸光度。由于核苷酸、RNA、单链DNA和双链DNA都在260 nm处吸收，因此它们将检测样品的总吸光度。观测指标也就是260/280 and 260/230 Ratios，所以下面分别介绍：
260/280 Ratio

260 nm和280 nm处的吸光度比用于评估DNA和RNA的纯度。通常认为~1.8的比例是DNA的“纯”比例；一般认为~2.0的比率为RNA的“纯”。如果这两种情况下的比率明显较低，则可能表明存在蛋白质、苯酚或其他污染物，这些污染物在280 nm处或附近强烈吸收。
260/230 Ratio

这个比率被用作核酸纯度的第二个衡量标准。“纯”核酸的260/230值通常高于相应的260/280值。预期的260/230值通常在2.0-2.2范围内。如果该比率明显低于预期，则可能表明存在在230 nm处吸收的污染物。




图1 核酸的典型光谱模式




图2 EDTA光谱模式（碳水化合物和苯酚的吸光度都在230nm附近。）




图3 TRIZOL光谱模式（TRIZOL试剂是一种酚类溶液，在230 nm和~270 nm的紫外线下都能吸收。）




图4 Guanidine HCl光谱模式（用于DNA分离的盐酸胍将在约230 nm处吸收）




图5 Guanidine Isothiocyanate光谱模式（用于RNA分离的异硫氰酸胍将在约260 nm处吸收）

清风寡欲

核酸提取是分子生物学研究的基础，而提取的核酸质量好坏也是决定下游实验成败的关键因素之一。因此了解核酸提取的基本原理和方法至关重要，一起来学习下吧！
一、什么是核酸
核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两类，其中DNA主要集中在细胞核内、叶绿体和线粒体中，而RNA则主要分布在细胞质中。核酸是分子生物学研究的主要对象，那么无论是对核酸的结构还是核酸的功能进行研究，都需要对核酸进行提取和纯化。
二、核酸提取的基本步骤
1.裂解细胞，释放核酸：使用裂解液裂解细胞，使核酸游离在裂解体系中；
2.核酸的分离与纯化：除去和核酸结合的多糖、脂类、蛋白质等生物大分子物质以及其他杂志分子；
3.核酸富集与洗脱：采用洗脱液处理，富集核酸。
三、核酸提取纯化的常见方法与选择
（一）核酸提取方法——溶液法、柱膜法、磁珠法
1.溶液法


最经典的核酸提取方法是溶液法。细胞破碎或者组织匀浆后用苯酚氯仿处理，在水相中主要是以DNA为主，有机相中主要是多糖和脂类物质，蛋白质沉淀于两相之间。离心分层后取水层，经过多次重复操作，并合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇/异丙醇来沉淀核酸，然后再进行分离和纯化、溶解后即可得到高纯度核酸。
2.柱膜法


柱膜法原理是基于硅胶膜吸附。硅胶膜表面存在的硅醇基团呈弱酸性，水化后带负电。如果溶液中存在一定浓度的阳离子时，会中和DNA硅醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA能够牢固地吸附在硅胶膜表面。反之，如果处于低盐水溶液时，DNA磷酸基团和硅胶膜的硅醇基团之间会存在静电排斥，硅胶膜将DNA释放出来。
3.磁珠法


磁珠法运用的是纳米技术，对超顺磁性纳米颗粒的表面进行修饰和改良后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别并高效结合。核酸结合到磁珠上主要是依靠氢键作用、静电作用和疏水作用。在异硫氰酸胍、盐酸胍和外加磁场的作用下，能从样本中将核酸分离出来，并洗去非特异性吸附的杂质，得到纯化后的核酸。
（二）磁珠法与柱膜法的比较


（三）提取方法的选择
如果对核酸提取的质量要求不高，可以选择经济实惠的溶液法，选择柱膜法还是磁珠法自动化提取，基本上取决于样本数量，针对大批量的样本，优选磁珠法自动化提取。如果对样本数量较少，则可以选择柱膜法，既快速又经济实用。

感恩由您

核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，是分子生物学研究的主要对象。如果要对核酸的结构和功能进行研究，首先就要对核酸进行提取和纯化。

核酸提取是个啥？字面意思，就是把核酸从样本中提取出来呗！本文将从核酸提取的常用方法、如何避开操作雷区等几个方面展开，还有小福利小彩蛋哦~

1. 常见的提取方法有哪些？






表 1.核酸提取的常见方法

• 核酸提取步骤
  

核酸提取主要包括细胞裂解、核酸吸附、杂质漂洗和核酸洗脱四步。那具体到实验中，我们该选择哪种提取方法呢？这就要看个人的实验设计方案及实验组的经费情况啦！

磁珠法提取效果当然很好，但贵是真的贵，而且还得购买配套的磁力架，批量提取的话，还是不太建议的！自配试剂的优缺点是显而易见的，若后续实验对核酸要求不高 (如常规的 DNA 提取，后续用做普通 PCR 扩增)，这种提取方法也可选择。

但如果对核酸的质量要求比较高 (如定量或文库构建等。尤其不能忽略的是 RNA 提取中的降解和纯度问题)，还是比较推荐受众度较高的离心柱法；至于质粒提取，考虑到纯度与浓度，肯定也选择这种性价比较高的离心柱法啦！  




图 1. 离心柱法核酸提取流程图


2. 如何避开操作“雷区”，拿到高纯度核酸？

RNA 提取过程中常见问题盘点 (此处主要针对 RNA 提取，文末彩蛋有 DNA 和质粒提取注意事项汇总哦)。  
RNA 提取后续试验主要包括 PCR、RT-PCR、qPCR、cDNA 文库构建等，RNA 没提好，后面的实验问题也是连贯性的，一个不小心可就都 game over 了。这个 RNA 提取，真的是……脑壳疼！ 来来来，这道题，我们重点讲一下。   
影响 RNA 得率低的因素很多？抽提 RNA，当然要做到 “三从四德”。 一从：外源酶污染？NO！
二从：内源酶活性？NO！
三从：抽提目的性？YES！ 一德：使用无 RNase 耗材，选择合适的操作环境。
二德：确定样本后选择合适的裂解液，样本与裂解程度不匹配，抽提结果也会大打折扣。
三德：裂解、匀浆、抽提、洗脱——快！准！狠！
四德：衡量抽提性价比的标准是后续实验的结果，得率不是唯一标准。即我们需要明确下一步的实验，如果是 PCR，其实验本身对 RNA 的质量要求没有那么高，而 qPCR 对 RNA 的要求相对又高点，但如果要做 cDNA 文库构建，其对 RNA 的要求就很高了，因此 RNA 质量便是 “经济基础” 了，颇有 “一损俱损” 的感觉了。
小白: “三从四德” 我也懂，但 RNA 得率这么低具体是为什么呢？
小M：还不是因为 RNA 太娇贵，放太久会降解，环境不干净会降解，吹口气也能降解~   


3. 彩蛋时间到！！! (含 DNA 和质粒提取注意事项）








别急，还有福利

4. 试剂盒 免费 试用装来啦！！！ （好用不好用，试试就知道，反正免费滴~）

MCE 新推出三款核酸提取纯化试剂盒，均利用硅胶膜离心柱对核酸进行特异性吸附，改良的裂解液可以促进细胞充分裂解、蛋白变性、核酸释放；改良的吸附缓冲液能有效地促进核酸结合到硅胶膜上；最后经过洗脱即可获得高纯度核酸。

1. 基因组 DNA 小量抽提试剂盒：
我适用于从动物组织/细胞、酵母、大肠杆菌等样本中有效提取并纯化基因组 DNA，内含 蛋白酶 K 可去除蛋白污染，经纯化的基因组 DNA 后续可用于 PCR、qPCR、酶切、Southern Blot 等实验。

2. 病毒 DNA/RNA 抽提试剂盒：
我适用于从血浆、血清、全血、组织匀浆液、痰液、动物细胞上清等中提取病毒 DNA/RNA。我不仅包含 蛋白酶 K，更有核酸助沉剂助力，提取的核酸那可不团团来嘛！纯化的病毒 DNA/RNA 可用于 PCR、RT-PCR、qPCR 等实验。

3. 质粒大量抽提试剂盒：
我适用于从 ≤500 mL LB 培养基培养的大肠杆菌细胞中高效的提取质粒 DNA。RNase A 可对 RNA 进行清除，柱上去除内毒素，Very good!

MCE 新上线核酸提取试剂盒 (离心柱型)，尝鲜试用装，抓紧时间领取吧！

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