蛋白质组学技术在免疫学研究中的应用

临床医师

南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室     王旻茜，李冬海

       摘要：蛋白质组学技术是一种高通量、高效率的全新技术手段，已被广泛应用在免疫学多个方向的研究中。本文总结了蛋白质组学技术在免疫细胞、肿瘤免疫、致病菌/病毒抗原物质筛选和器官移植各个免疫研究领域的应用及最新进展。蛋白质组学技术的应用大大促进免疫相关的基础研究和疾病的诊断、治疗以及新药开发。
       关键词：蛋白质组学；免疫学；肿瘤免疫；器官移植

1 引言

       随着蛋白质组学的飞速发展，蛋白质组学技术也日新月异，层出不穷。蛋白质组学涉及到的主要技术包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术和生物信息学技术等。经典的蛋白质分离技术主要包括二维凝胶电泳分离技术、液相色谱-质谱分离技术以及蛋白质芯片（protein chip）。二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。荧光双向差异凝胶电泳（fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis，DIGE）是近些年来发展起来的技术。DIGE 用不同的荧光染料标记待比较的蛋白质样品,这种方法灵敏度高，重复性高，加快了蛋白质组学的发展。二维色谱技术一般几小时可完成全部分离，相比于2-DE 分离一般需要1-2 天要快很多。同位素编码亲和标签（isotope-coded affinity tag，ICAT）-亲和色谱-质谱技术使用一对ICAT 能很好地定量分析微量蛋白质。蛋白质芯片或称蛋白质微阵列(protein microarray) 是高密度的蛋白质阵列，分析快捷、高效、并行、高通量，利用标记了特定荧光染料的蛋白质与固定于芯片上的成分互补结合可以分析蛋白质之间相互作用关系。蛋白质鉴定技术中的高通量质谱（mass spectrometry, MS）鉴定技术经历了由电喷雾电离（electrospray ionization ，ESI）质谱，基质辅助激光解吸电离飞行时间（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MAILDI-TOF）质谱再到傅立叶变换离子回旋共振质谱（Fourier transform ion cyclotronresonance mass spectrometry ， FTICR-MS ） 表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（ surface-enhanced laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry ，SELDI-TOF-MS）和Orbitrap MS 的过程，质谱技术仍然在不断地发展，仪器的性能也越来越优良。生物信息学技术为后期分析质谱数据，将谱图与蛋白结构联系起来提供了途径。本文主要阐述蛋白质组学技术在免疫学多个研究领域（包括免疫细胞、肿瘤相关的免疫研究、免疫原性物质鉴定和器官移植等研究）的应用及最新进展。蛋白质组学技术的通量方面、灵敏度、高效性、经济上都相对传统的研究方法有很大优势，极大推动了免疫学的发展。

2 蛋白质组学技术在免疫学研究中的应用

2.1 蛋白质组学技术在主要免疫细胞研究中的应用

       免疫细胞泛指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，主要包括T 淋巴细胞和B 淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等。蛋白质组学技术广泛引用到该领域的研究，并取得了大量有价值的成果。
       未激活的外周血T 细胞是静止期细胞，它缺少负责细胞分化所需的许多蛋白质。首次进入细胞周期的T 细胞需要32-40 小时进入S 期，而周期性细胞通常需要25.6 小时完成一次完整的细胞周期。Stephen J Orr 等采用基于非标记质谱方法鉴定染色质和核基质（chromatin and the nuclear matrix，C/NM）相关蛋白以及与C/NM 未结合的蛋白，这些蛋白是他们进入细胞周期时，在原代人T 细胞中被调控的。他们首次报道了细胞周期转换过程中受调控的蛋白质相互作用网络，此外还鉴定了已知和全新的在进入细胞周期的T 细胞激活过程。结果还表明进入细胞周期（cell cycle）和生长周期（growth cycle）能够在原代人T 细胞分开，剪切因子3B（SF3B）是进入细胞周期所必需的，而生长周期却缺少的，而且与60S 核糖体生成相关的eIF6 调节细胞进入生长周期，而不是细胞周期。
       B 细胞可以产生抗体，是免疫系统的一个重要部分。B 细胞在人和老鼠的骨髓中发育，而鸡的B 细胞却在法氏囊（内脏相关的淋巴组织）发育。为了更好的了解这个重要的生物学过程，Korte J 等利用蛋白质组学技术研究了这个器官的蛋白质动力学。四个发育阶段的样本被分析，并且利用2D DIGE 方法进行了比较。他们发下了153 个蛋白质发生了明显的变化，并用质谱进行定性。部分蛋白主要与视黄酸代谢和肌动蛋白细胞骨架紧密相关。免疫组化的结果表明结蛋白（desmin）是与B 细胞滤泡成熟相关的基质细胞蛋白。细胞内氯离子通道蛋白2 有10.8 倍的差异，暗示着该蛋白在法氏囊B 细胞发育过程中具有重要的功能。B细胞来源于淋巴干细胞，发育可经过祖B细胞（progenitor B cell, pro-B）、前B细胞（precursor B cell, pre-B）、不成熟B 细胞（immature B cell）及成熟B 细胞（mature B cell）几个阶段。抗原受体基因重组以及细胞表面的表达都在B 细胞发育过程中起着至关重要的作用。Deok Ryong Kim 利用2-DE 和质谱等蛋白质组学技术分析了B 细胞不同发育阶段蛋白表达谱。结果发现一些转录因子如E2A 和Pax5 在B 细胞发育早期表达，在晚期受到抑制。RAD52 相关的蛋白和染色质重组因子1（chromatin assembly factor 1）在B 细胞早期大量表达。这些B 细胞发育蛋白差异研究使我们对这个过程的分子基础有了更深入的认识。
       单核细胞到巨噬细胞成熟对于动脉粥样硬化是一个关键过程。Mary Y. Chang 等利用MALDI-TOF/TOF MS 等技术研究了此过程的分化和激活是如何影响蛋白聚糖的产生以及对动脉粥样硬化发生的作用。该论文报道THP-1 未成熟单核细胞和成熟巨噬细胞可以合成和分泌丝甘蛋白聚糖以及另一种富含的蛋白聚糖——淀粉前体样蛋白2（amyloid precursor-like protein 2, APLP2）和蛋白聚糖相关分子——间α-抑制剂重链2（inter-α-inhibitorheavy chain 2），这个蛋白与巨噬细胞分泌产物的蛋白聚糖片段有关。与基质稳定性相关的其他分子表达也发生明显改变，如多功能蛋白聚糖（versican），TNF-stimulated gene-6 和透明质酸合成酶（hyaluronan synthases）。这些结果暗示巨噬细胞合成许多参与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）形成和行使功能的分子，进而提示这些分子在动脉粥样硬化发生过程中的巨噬细胞分化起着重要作用。对于单核细胞和巨噬细胞的蛋白质组学已经研究很多，从经典的二维电泳技术到最近的基于质谱的高通量技术都广泛用于此研究。Annalisa Castagna 等对此进行了总结，并阐述了两种免疫细胞与动脉粥样硬化和离子代谢紊乱疾病的相关性。

2.2 蛋白质组学技术在肿瘤相关免疫研究中的应用

       用肿瘤疫苗来治疗人类肿瘤的想法在两个世纪前就提出，然而研制肿瘤治疗性疫苗的前提是需要获得特异性肿瘤抗原。肿瘤是一个复杂多步骤的过程，它不仅与基因改变有关，而且与破坏细胞生长和分化调控的因子直接相关。大量研究已经证明癌症血清中包含一些可以与自体细胞抗原直接作用的抗体。这种自体细胞抗原称作肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAA），它们诱导自身抗体应答。这种细胞蛋白种类繁多，包括肿瘤抑制因子p53，p16，致癌产物如c-Myc，HER-2/neu 和CIP2A/p90，以及阻碍mRNA 降解的蛋白如酪氨酸酶（tyrosinase）和肿瘤/睾丸抗原（cancer/testis antigen），抗凋亡蛋白如survivin 和LEDGF。
       蛋白质组学技术的飞速发展，为这个领域的研究提供了一个良好契机，并取得了可喜的结果，鉴定了大量的肿瘤相关抗原，例如成神经细胞瘤的β微管蛋白I 和III、乳腺癌的RS/DJ-1、肺癌的PGP-9.5 /Annexin I/Annexin II、淋巴瘤相关的L-plastin、食道鳞状细胞癌HSP70/Prx VI。MHC（major histocompatibility complex）肽也是潜在的非常有效的肿瘤相关抗原，一些MHC 抗原已经被发现可以被循环的细胞毒T 细胞识别并接着做了实验动物的体内、体外实验，和临床试验。目前，对癌症生物标志物的研究已经取得了一定的进展，人们鉴定出了肾癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等癌症标志物分子。蛋白质组学技术也存在潜在缺陷，由于2-DE 的多种限制，很可能错过一些潜在的TAAs。免疫沉淀结合溶液内降解（in-solution digestion）方法优于前者。但要注意的是，并不是所有患者体内都有这种抗体，而且由于这种抗体的低选择性，该方法离实际应用还有很大的距离。

2.3 蛋白质组学技术在寻找病原菌/病毒免疫原性物质研究中的应用

       病原菌的免疫原性物质在其致病过程、预防、诊断和治疗中占有至关重要的位置。免疫蛋白质组学方法自建立以来，即被广泛地应用于多种微生物的免疫原性蛋白研究中。
       Boyer AE 等开发了一种在血清中检测功能性致死因子（一种锌依赖的包内蛋白酶）的方法。这种方法用来检测感染炭疽杆菌（Bacillus anthracis）恒河猴血清中致死因子的水平，结果展示这种方法可以高度特异性地、快速地诊断早期炭疽感染。
       系统性念珠菌病是遭受血液恶性肿瘤病人的主要致死原因。白色念珠菌（candida Albicans），为条件致病性真菌。它广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，但是正常情况下，机体含有比较少，不引起疾病。Aida Pitarch 等深入研究了白色念珠菌的免疫原蛋白。他们利用蛋白质组学技术在病人血清中鉴定85 个免疫反应蛋白。蛋白质组学结果确定了42 个不同的管家酶作为该菌的抗原。其中26 个蛋白在该菌中展现抗原性质，其中35 个是抵抗该疾病分泌抗体的靶点。针对该菌phospoglycerate kinase 和alcohol dehydrogenase 产生的抗体是与人免疫应答的变异紧密相关。
       幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）在1983 年首次从胃炎患者的胃粘膜活检组织中分离，是一种革兰氏阴性、螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。在幽门螺旋杆菌感染过程中，从细菌中分泌出的抗原会引起强烈的免疫应答，这些抗原被认为是潜在的感染标志物。Akbar Khalilpour 等研究了四组与幽门螺旋杆菌感染相关的人血清样本：第一组，组织活检和血清样本都显示幽门螺旋杆菌阳性，这组包括2 个十二指肠溃疡病人，5 个胃溃疡病人，20 个胃炎病人和3 个普通病人；第二组，健康对照组；第三组，有胃肠问题，但幽门螺旋杆菌阴性的30 位病人；第四组，具有伤寒、志贺氏菌病等其他疾病的病人30 位。他们利用MALDI-TOF/TOF 等蛋白质组学技术详细鉴定和分析了这些样本，并确定了抗原蛋白。基于质谱的结果这些蛋白分别是：CagI（25 kDa），脲酶G 辅助蛋白（urease G accessory protein，25 kDa）， UreB（63kDa）和prolin/pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase（118 kDA）。这些蛋白对于幽门螺旋杆菌感染的病人诊断非常有价值。Yu-Fen Lin 等也利用质谱技术研究了来自幽门螺旋杆菌的十二指肠溃疡相关抗原。最终，三个十二指肠溃疡相关抗原——FusA， KatA 和UreA（EF-G，FusA；catalase，KatA；urease α subunit，UreA）被鉴定，潜在用来诊断幽门螺旋杆菌感染导致的十二指肠溃疡。统计学分析表明这三个抗原复合使用的效果要大大优于单个抗原的应用。
       目前，由于病毒基因组测序的快速发展，基因表达分析和新兴的蛋白质组学技术允许我们更深入的了解病毒蛋白以及病毒-宿主间的相互作用。人们利用基于质谱的蛋白质组学方法已经详细研究了与临床相关的病毒的蛋白质表达，包括的病毒有丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus）、人免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus type 1 virus, HIV-1）、流感病毒（influenza virus）、严重急性呼吸综合症（severe acute respiratory syndrome）病毒、人类呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus）等，下面简述一下HIV-1 和流感病毒的蛋白质组学研究结果。
       HIV-1 是逆转录病毒家族中的RNA 病毒，它可以特异通过摧毁T 细胞的免疫功能而引起致命疾病。HIV-1 表面糖蛋白（HIV-gp120）与宿主细胞（如CD4+T 细胞）受体的作用是病毒进入来启动感染的关键步骤。Borchers C 等利用蛋白质组学技术确定了gp120/CD4 复合物的存在。二维电泳技术和MALDI-TOF 也用来鉴定cyclophilin A 的异形体（isoform）存在，根据等电点可以分为三种：6.4，6.53 和6.88.其中pI 6.53 在黏附到病毒颗粒表面起着重要作用。蛋白质组学技术也用来鉴定生物标志物，来改善HIV 诱导的神经退行性失调诊断，例如HIV-1 相关的痴呆（HIV-1 associated dementia，HAD）。据报道，凝溶胶蛋白（gelsolin）和前白蛋白（prealbumin）在痴呆样本中有明显变化，可以作为潜在的诊断生物标志物。
       流感病毒属于正粘病毒科，是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行性感冒的RNA病毒。流感病毒根据核蛋白的抗原性可以分为三类：甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒。血球凝集素（Hemagglutinin，HA）对于疫苗设计和抗病毒药物开发非常重要。质谱技术可以快速鉴定不同流感病毒的HA 亚型，来改善疫苗制备和生产的效率和效果。为了研究感染过程中宿主细胞应答，Liu 等分析了H9N2 感染的差异表达蛋白，鉴定了34 个表达有变化的宿主蛋白。其中细胞质肌动蛋白（cytoplasmic actin）和细胞角蛋白（cytokeratin）有明显变化。巨噬细胞与流感病毒感染的先天免疫应答的激活高度相关。Lietzen 等利用定量蛋白质组学技术定量研究了人甲型流感病毒感染的原代巨噬细胞。感染后不同时间的样本蛋白被详细研究，结果发现线粒体，细胞浆和细胞核成分以及感染巨噬细胞的分泌组被进行蛋白质组学分析，分别有1999，1423，1230 和627 个蛋白被鉴定。一些凋亡相关蛋白、干扰素诱导蛋白，线粒体和溶酶体蛋白发现在病毒感染过程中有表达差异。由于蛋白质组学技术不但可以定量，而且还可以研究样本的动态变化，因此对于研究病毒感染相关的免疫变化具有很大优势。
       另有一些与寄生虫的入侵、增殖及发病有关特异性抗原。Costa RM 等研究了由于恶性疟原虫引起疟疾病人样本，鉴定了主要免疫原蛋白。这些蛋白的分子量在40-60kDa 之间，包括延长因子1α（ elongation factor-1 α) 、蛋白二硫化物异构酶（protein disulphide isomerase，）、 磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase）、78kDa 葡萄糖调节蛋白同源物（78 kDa glucose-regulated protein homologue）、棒状体相关蛋白2（rhoptry-associated protein2）和棒状体相关蛋白3。与以前的研究结果一致，这些被鉴定的免疫原蛋白对于寄生虫在宿主中的生存起着关键作用。

2.4 蛋白质组学技术在器官移植中的应用

       首次器官移植出现在1954 年美国波士顿一所医院。之后，心、脏、肾脾、胰腺、骨髓、肾上腺、胰岛、甲状旁腺、肺、睾丸、关节、胎胰、胎甲状旁腺、胎肾、胎胸腺、胰肾联合、肝细胞、脾细胞、脑细胞和神经组织等的组织和器官在临床上都开展了移植。排斥反应是器官移植失败的最主要原因之一。当前，器官移植损伤估测的方法具有入侵性并且灵敏度和特异性差，器官移植后检测方法急需改进。新兴的蛋白质组学技术将会大大推进这方面的研究。下面主要阐述蛋白质组学技术在肾脏和肝脏移植方面的应用。
       肾脏是最常见的被移植的器官，移植肾脏由于免疫或非免疫相关的排斥导致功能丧失的危险是很高的。蛋白质组学技术在肾脏移植中的应用主要是对组织活检、血清和尿液蛋白质成分的检测。由于间质纤维化肾小管萎缩（interstitial fibrosis tubular atrophy）是肾脏移植失败的一个主要原因，Aleksey Nakorchevsky 等对有不同程度的间质纤维化肾小管萎缩的活检样本用质谱方法进行了蛋白质表达的检测，超过1400 种蛋白质独特的表达谱能够记录从正常组织到轻微再到严重疾病的逐渐发展过程。多种蛋白质组合可以定位到功能通路中，包括免疫应答，炎性细胞激活和细胞凋亡。慢性移植肾病（Chronic allograft nephropathy，CAN）是肾移植一年后病人的主要死因。Olwyn Johnston 等研究了34 个具有CAN 疾病和36 个正常肾移植无CAN 的病人。SELDI-TOF-MS 来研究他们的尿液样本。一个11.7kDa 的β2 微球蛋白（β2 microglobulin）被鉴定在CAN 患者中具有更高浓度。这个蛋白可以作为潜在诊断CAN 的生物标志物。器官移植的急性器官排斥反应（acute rejection）是肾移植主要危险因素，迄今没有非入侵的诊断生物标志物。Tara K. Sigdel 等使用液相质谱串联技术和ELISA 检测了92 个尿液样品。这些尿液样品来自于急性排斥反应患者，稳定的移植患者，蛋白尿患者和作为对照组的健康人。一共有1446 种尿液蛋白质被发现，能区分出蛋白尿特异蛋白、肾移植特异蛋白和急性排斥特异蛋白。急性排斥反应特异蛋白主要与MHC 抗原，补体级联反应和细胞外基质蛋白相关。尿调节素，SERPINF1 和CD44 在ELISA 中也被确定在急性排斥反应患者尿蛋白中表达显著不同。对血清和尿液进行检测造成的伤害小，风险低，是更优的检测手段。
       Omar Massoud 等用蛋白质组学技术并结合ELISA方法研究分析了出现急性细胞排斥和没有出现急性细胞排斥肝移植受者的血清。在发现的41 种表达显著不同的蛋白质中，七种可以由基于ELISA 的方法进行验证。其中补体成分C4 和C1q 都是急性细胞排斥反应的独立预测物。以C4≤0.31g/L 和转氨酶ALT≥70IU/mL 共同作为判断标准敏感性为96%，专一性为81%，正预测值为86%，负预测值为94%。原位肝移植实施的过程中，在某些供者-受者鼠品种的组合中，例如DA (RT1a) -PVG (RT1c)，不使用免疫抑制剂也完全能够克服主要组织相容性复合体障碍，相同组合其他器官以相似的方式移植却没有这种现象。Tai-Long Pan 等使用蛋白质组学技术检测了正常动物与接受了原位肝移植并使用POD60 作为免疫抑制剂的动物的血清以理解产生免疫耐受的血清蛋白的功能及在免疫应答中的调控。检测的蛋白质中，与抑制T 细胞增殖有关的结合珠蛋白（haptoglobin, Hp）在原位肝移植后表达上调；体外实验中结合珠蛋白同样对混合淋巴细胞反应有免疫抑制作用，从而认为结合珠蛋白可能在肝移植的自发性耐受有重要的调节作用。
       移植技术越来愈成熟，但排斥反应仍然是被移植器官功能和存活的最大威胁。目前使用蛋白质组学技术对肾脏、肝脏和肺脏移植的研究较多，基于蛋白质组学技术的心脏移植排斥反应机制和生物标志物的研究并未见报道，但可期待在不久的将来就会有类似的研究和发现。

3 结语

       蛋白质组学方法作为一种高通量的灵敏的技术手段，在研究复杂系统时有很大优势。在免疫学中，蛋白质组学技术对筛选疫苗靶位，发现新的自身抗体，了解免疫机制等都有很重要的作用。蛋白质组学技术可以用来大规模地开展免疫分子和免疫应答机制的研究，相信这样可以将众多的免疫研究结果联系起来，更深入和系统地认识免疫反应，并推动免疫学的发展。

winliu

学习了，谢谢楼主，辛苦啦