用流式细胞仪做免疫荧光鉴定，如何制备细胞上机？

幸福侠侣

鉴定hips细胞，用流式的方法，使用直标法染色，如何制备细胞染色上机？

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与大多数科学技术一样，在准备流式细胞术样品时，“垃圾样品，垃圾数据-(garbage in, garbage out)”这句格言很贴切。从高质量样本开始是获得可靠、高质量数据的第一步。以下是一些关于应对样品制备过程中常见挑战的专家建议，以及提高流式细胞术数据质量的其他技巧。
提前计划样品制备
尽管直接投入新的方案可能会令人兴奋，但也不要试图省去仔细的准备工作，即使这意味着需要更多的步骤或一些额外的时间。规划所有准备步骤并留出足够的时间—更好的数据带来的好处将远远超过麻烦。流式细胞术应用科学家Sharon Sanderson 表示：“一切准备就绪，开始准备样品后，就可以避免处理过程中的任何延迟，并避免样品在工作台上放置的时间超过必要的时间”。“收获和染色之间的时间过长可能会导致脆弱细胞（如粒细胞）的活力较差或丢失。” 如果可能的话（根据实验的性质适当）将样品保持在 4℃ 冷却，以减少坏死和细胞凋亡。
优化固定和透化
优化固定和透化可能具有挑战性，特别是当您同时研究细胞内和细胞外蛋白质时，因为这些类型的分子使用不同的方案。例如，细胞外蛋白质可进行表面染色，但可能会受到用于接触细胞内蛋白质的透化试剂的不利影响。
Proteintech 产品经理建议“细胞内靶标需要更复杂的方案来固定和透化细胞，以允许试剂进入细胞，” “如果要对核蛋白进行染色，则需要更严格的透化方法，不仅要穿透细胞膜，还要穿透核膜。” 她建议如果可能的话，尽量简化固定，因为虽然它“有助于样品保存，但它也会增加细胞的自发荧光。”
优化条件包括平衡健康的细胞外染色与充分获取细胞内蛋白质。您可以根据文献资料来自行优化，或利用可用的高质量商业固定和透化缓冲液。她指出，一些抗体制造商用特定的商业缓冲液验证他们的产品。“这使得样品制备和方案设计变得更加容易，因为您有一种经过验证的方法可以使用，例如 Proteintech 的 FoxP3/转录因子染色缓冲液试剂盒，”她说。
制作和保存单细胞悬浮液
制作和维持单细胞悬浮液对于流式细胞仪有效计数细胞和标记物至关重要。尽管某些样品很容易实现这一点，但其他样品（例如固体组织）可能更难以转化为单细胞，因此您可能需要尝试多种方法来找到最适合您的样品类型的方法。研究文献中的方法是一个很好的起点，可能包括切碎组织、过滤网筛选、酶消化的组合。“您希望通过以对细胞损伤尽可能小的方式收获细胞或解离组织来保持细胞的完整性，” Sanderson说。“如果您对稀有细胞类型感兴趣，您可能希望选择更温和的方法，例如分散酶等中性蛋白酶，这是一种比胰蛋白酶更温和的治疗方法。”
获得单细胞悬浮液后，Sanderson建议在显微镜下进行目视检查，寻找单个细胞而不是细胞团，并验证是否有足够的细胞用于计划的实验（使用细胞活力染料并使用血细胞计数器或自动细胞计数器进行计数在这里很有帮助）。 “这可以帮助您避免浪费昂贵的染色试剂并从不良样品中获取数据，”她说。
您的单细胞悬浮液可能需要进一步的刺激才能保持无团块。“添加 DNAse I 或 EDTA 可以减少死亡和垂死细胞释放的 DNA 团块的形成，”Sanderson 说。“在采集样品之前，您可以通过将制备物通过70 µm 细胞过滤器，进一步帮助去除可能堵塞细胞仪或损害结果的团块。”
去除污染细胞
当从混合细胞类型的组织中制备样品时，去除不需要的细胞尤其重要。“这方面的例子是，在收集骨髓和红细胞时，确保去除骨骼中的所有肌肉，肌肉细胞会使得流式细胞术检测白细胞变得困难，”桑德森说。通常使用密度梯度或低渗裂解去除红细胞 (RBC)，低渗裂解通过渗透压使红细胞破裂。“可以使用水、氯化铵或专门的红细胞裂解液，例如 Erythrolyse，”Sanderson 说。“必须小心确保红细胞充分裂解，而不是将细胞留在裂解溶液中太长时间，因为这会导致白细胞的细胞死亡增加。”
临床采样挑战
使用新鲜血液进行转化分析的临床研究可能会在样本运输和储存过程中遇到挑战。运输生物样本的效果部分取决于样本类型和计划的检测方案。Precision for Medicine 是一家全球临床研究组织，提供全面的临床试验服务以推进药物开发，并拥有一支全球物流团队，为安全样本运输提供建议。Precision for Medicine 转化生物学高级总监 Angelina Bisconte 表示：“当临床场所需要进行样本处理工作，或者样本预计运输时间为 24 小时或更长时间时，往往会出现挑战。”
Precision 建议对需要在 8 小时内进行检测的样本使用血液固定剂或稳定剂。直接吸取管中包含的固定剂可提供长达 96 小时的稳定性。“使用可用的血液稳定剂，血液样本可以在冰箱中保存数月并进行批量处理，” Bisconte说。“我们使用商业稳定剂进行批量受体占用测定取得了相当大的成功，这是一些最具挑战性的流式测定。” 与任何试剂一样，测试血液固定剂或稳定剂在流式细胞术测定中是否发挥良好作用非常重要。“我们认为了解样品运输对我们的检测读数有何影响以及如何最大限度地减少任何问题非常重要，” Bisconte说。“投入时间与 Precision 合作，以便我们能够科学地实现每项临床研究的目标，我们可以提供最全面的建议，以帮助最大限度地提高用于样本检测的样本质量。”
这种额外的准备时间绝不会被浪费。“不要低估样品制备的重要性，因为如果您的样品不理想，您的结果也将不理想，” Sanderson说。
提高流式细胞术的样品制备





文章来源：Biocompare

大力水手

分拣前的准备工作
培养条件：在分选之前，确保您的细胞处于最佳状态，最好处于指数生长期。这增强了它们的弹性和分拣后的恢复能力。
培养基准备：准备适合您的细胞类型的新鲜培养基。如果与您的实验设计兼容，请考虑在培养基中添加抗生素和额外的血清以支持细胞恢复。



细胞分选试剂

排序注意事项
分选参数：选择温和的分选参数以最大限度地减少细胞压力和损伤。如果可能的话，这包括使用更大的喷嘴尺寸和更低的压力。
收集管准备：用含有血清的培养基预填充收集管，以提供即时营养并减少收集时的休克。保持管子低温以保持细胞活力。
重新电镀协议
立即处理：分选后尽快处理分选的细胞，以尽量减少压力和细胞死亡。如果无法立即处理，请将细胞置于冰上。
离心：以低速离心机低速（约 200-300 xg，5-10 分钟）轻轻离心分选的细胞，以沉淀细胞，同时最大限度地减少压力。

离心机多少钱一台-离心浓缩仪-超速离心机价格-台式高速离心机重悬：小心吸出上清液，不要扰乱细胞沉淀。将细胞重悬于根据您的细胞类型需求定制的新鲜、预热的培养基中，轻轻吹打以确保均匀的细胞悬浮液。
电镀密度：根据您的细胞类型和实验要求确定适当的电镀密度。较高密度的铺板可以通过促进细胞间相互作用来促进细胞恢复和生长。
培养条件：将细胞悬浮液转移至培养容器中，必要时预先涂有细胞外基质成分，以增强细胞附着和生长。将容器放入设置适当温度和 CO2 水平的加湿培养箱中。
监测和护理：在接下来的几个小时到几天内密切监测细胞附着和恢复。第二天更换培养基以去除任何死亡细胞和碎片，然后根据您的标准培养实践定期更换。
排序后分析
活力评估：在分选后 24-48 小时内进行活力测定（例如，台盼蓝排除或基于 ATP 的发光测定），以评估重铺过程的成功程度，并在必要时调整培养条件。
扩增和分析：一旦细胞充分恢复和增殖，即可继续进行实验分析或根据需要进一步扩增培养物。
结论
FACS 分选后遵循此方案重新接种细胞可以显着增强细胞活力和增殖。细胞的温和处理，加上优化的培养条件，为分选后细胞研究的成功继续奠定了坚实的基础。

清风寡欲

挑错有礼WILL BE BETTER

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随着业务的扩展，近来不少新的用户伙伴都在好奇我们超分辨率显微成像系统iSTORM的操作流程（样本制备、拍摄操作等），所以这一期我们力显小课堂就准备了其中一个步骤，固定细胞样本制备的方法分享哦。
为了提升大家的学习趣味，我们还在分享视频中故意留下了几处新手会常犯的操作失误，供大家发现，谁发现的多，谁就有大礼拿！快来看看吧！

一、活动奖励：
1、成功在上文视频中挑错5个及以上（错误不重复）
奖实验计时器、笔记本、名片夹，三选一。




2、截至活动结束，哪位累计挑错最多（错误不重复）
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二、活动规则
1、本活动仅面向各院校、医院、实验室的老师学生（兑奖时会核实）；
2、礼物数量有限，先到先得，以添加客服企业微信的时间为准；
3、每个ID/手机号/微信号/地址，仅限领取1份礼物。

三、活动时间
即日起至2022年10月27日（28号开始核实兑奖）


*活动最终解释权由力显智能科技拥有。

欢迎转发给身边需要的朋友

长长的路

流式细胞仪（flow cytometry，FCM）是集激光设备、电子信息技术、光学精确测量技术性、电子信息技术及其体细胞莹光技术性、单克隆抗体技术性为一体化的新式新科技仪器设备，具备敏感度高、可重复性好、非特异强、方式灵便、剖析更快等优势，是当代最先进的细胞定量分析技术，广泛应用于生物医学领域，而熟练掌握流式细胞仪样品制备技术是正确使用该仪器的先决条件。
在典型的流式细胞术样品制备中，磷酸盐缓冲液 (PBS) 是一种常见的悬浮缓冲液，流式细胞术最直接的样品包括来自培养物、细菌、酵母、血液和组织的非贴壁细胞。对于细胞培养，细胞的生长速度最好是105 –107个细胞/ml，以防止流式细胞仪堵塞，分选速度约为2,000–20,000个细胞/秒。对于血液，通常通过简单的裂解步骤去除红细胞；然后通过它们的FSC/SSC特征快速识别淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。对于实体组织，例如肝脏或肿瘤，为了产生单细胞，实体材料必须通过机械或酶促分解。机械分解包括将切碎的组织悬浮液通过细针数次，然后根据需要进行研磨和超声处理。


酶用于破坏蛋白质-蛋白质相互作用和将细胞结合在一起的细胞外基质。它们的作用取决于包括pH值、温度和辅助因素在内的因素，因此在选择酶时要小心。

为了通过流式细胞术研究细胞内成分，例如细胞因子，细胞的质膜必须被通透以允许染料或抗体分子通过，同时保持细胞的整体完整性。最好是用低浓度（最高 0.1%）的非离子去污剂如皂苷。总之，样品制备方法将取决于起始材料和表位的性质。

1. 细胞的制备

(a) 储存在液氮中的细胞

1 制备 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）。

2 小心地从液氮储存中取出细胞。

3 使用 PBS/BSA 缓冲液快速解冻并放入 15 ml 锥形离心管中。

4 以 400 g 离心 5 分钟。

5 弃去上清液，用适量的 PBS/BSA 缓冲液重悬沉淀。

(b) 悬浮组织培养细胞系

1 制备 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）。

2 将组织培养瓶中的细胞倒入 15 ml 锥形离心管中。

3 以 400 g 离心 5 分钟。

4 弃去上清液，将沉淀重悬于 10 ml PBS/BSA 中。

5 以 400 g 离心 5 分钟。

6 弃去上清液，用适量的 PBS/BSA 重悬沉淀。

(c) 贴壁组织培养细胞系

1 制备 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）。

2 使用 2 ml PBS/BSA 缓冲液轻轻刮取细胞。

3 将细胞转移到 15 ml 锥形管中，并添加最多 10 ml 的缓冲液。

4 以 400 g 离心 5 分钟。

5 弃去上清液并将沉淀重悬于新鲜的 PBS/BSA (10 ml) 中。

6 以 400 g 离心 5 分钟。

7 弃去上清液，用适量的 PBS/BSA 缓冲液重悬沉淀。

(d) 从实体/淋巴组织制备细胞

1 将组织放在无菌培养皿上。使用含有约 15 ml PBS/BSA（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）的注射器和针头轻轻灌注组织，去除细胞。

2 将培养皿中的细胞悬液转移到 15 ml 锥形离心管中。

3 以 400 g 离心 5 分钟。

4 弃去上清液，将沉淀重悬于 PBS/BSA 中。

5 加入 10 ml 氯化铵裂解缓冲液。

6 混合并孵育 2 分钟，不要超过这个时间。

7 以 400 g 离心 5 分钟。

8 加入 10 毫升 PBS/BSA 并混合。

9 再次以 400 g 离心 5 分钟。

10 弃去上清液，用 PBS/BSA 重悬沉淀至终体积为 10 ml。

11 使用血细胞计数器计数细胞。

12 如有必要，调整细胞悬液，使最终计数为 0.7–1.2×107 个细胞/ml。

2. 细胞和血液的直接免疫荧光染色

该技术适用于荧光染料与一抗直接连接的情况，例如 PE、FITC 和 Alexa Fluor® 偶联物。

1 适当准备细胞（参见第 1 节）。用 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）将细胞悬液调整到 1 × 106 个细胞/ml 的浓度。

[全血样本可以未经稀释使用，除非细胞计数很高，例如白血病。EDTA 和肝素是首选的抗凝剂]。

2 将 100 μl 细胞悬液 [全血] 分装到所需数量的试管中。

3 以推荐的稀释度添加抗体。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

4 用 2 ml PBS/BSA 洗涤细胞，以 400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

[向血液悬浮液中加入新鲜制备的红细胞裂解缓冲液，例如 2 ml AbD Serotec's Erythrolyse，并充分混合。在室温下孵育 10 分钟。400 g 离心 5 分钟，弃去上清液]。如果需要，将细胞重悬于 0.2 ml PBS/BSA 或 0.2 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS/BSA 中。通过流式细胞仪获取数据。

3. 细胞和血液的间接免疫荧光染色

该技术适用于使用未偶联或生物素偶联的单克隆和多克隆抗体的情况。必须使用二级试剂来显示一抗，例如在生物素的情况下使用抗生物素蛋白。

1 适当准备细胞（参见第 1 节）。用 PBS/BSA 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA）将细胞悬液调整到 1 × 106 个细胞/ml 的浓度。

[全血样本可以未经稀释使用，除非细胞计数很高，例如白血病。EDTA 和肝素是首选的抗凝剂]。

2 将 100 μl 细胞悬液 [全血] 分装到所需数量的试管中。

3 以推荐的稀释度添加一抗。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

4 加入 2 ml PBS/BSA 缓冲液，以 400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

5 以推荐的稀释度添加适当的二级试剂。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

6 用 2 ml PBS/BSA 洗涤细胞，400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

[向血液悬浮液中加入新鲜制备的红细胞裂解缓冲液，例如 2 ml AbD Serotec's Erythrolyse，并充分混合。在室温下孵育 10 分钟。400 g 离心 5 分钟，弃去上清液]。

7 如果需要，将细胞重悬于 0.2 ml PBS/BSA 或 0.2 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS/BSA 中。

8 通过流式细胞仪采集数据。

4. 染色全血中的 lambda 和 kappa 链

该方法应与识别人κ和λ免疫球蛋白轻链的直接偶联双色试剂一起使用。检测特定于 B 淋巴细胞上的免疫球蛋白表达需要一个程序来去除血清免疫球蛋白，否则会引起干扰。

1 在抗凝剂中采集血液，例如 EDTA、肝素或酸性柠檬酸葡萄糖。

2 将 2–3 ml 全血分装到 25 ml 通用容器中。然后加入 20–25 ml PBS/BSA（磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% BSA），预热至 37°C，并充分混合。

3 以 400 g 离心 5 分钟。小心吸出上清液，注意不要干扰细胞沉淀。将沉淀重悬在残留的上清液中。

4 重复洗涤（步骤 2 和 3）两次。

5 将 100 μl 清洗过的血液分装到所需数量的试管中。以推荐的稀释度添加抗体（参见具体数据表）。充分混合并在室温下孵育 30 分钟。

6 添加红细胞裂解缓冲液，例如 2 ml AbD Serotec's Erythrolyse 并充分混合。在室温下孵育 10 分钟。400 g 离心 5 分钟，弃去上清液。

7 用 2 ml PBS/BSA 洗涤细胞，以 400 g 离心 5 分钟并弃去上清液。

8 如果需要，将细胞重悬于 0.2 ml PBS/BSA 或 0.2 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS 中。

9 通过流式细胞仪采集数据。

5. 用于分析细胞内细胞因子的全血方案

这是一种通过流式细胞仪分析细胞内细胞因子的快速而简单的方法。可用于分析小样本，并避免在通过密度梯度离心分离外周血细胞期间产生人为影响的干扰。所描述的刺激条件适用于 IFN γ、IL-2 和 TNF α。其他细胞因子可能需要不同的条件。该过程需要试剂盒来固定和通透细胞，其中我们推荐 Leucoperm T M。所有血样必须收集到肝素抗凝剂中。EDTA 会干扰细胞刺激过程，因此应避免使用。

1 将 0.5 ml 血液分别分装到 2 个试管中，然后在每个样本中加入 0.5 ml 细胞培养基（不含任何添加剂）。

2 向一个试管（静息种群）中加入莫能菌素，使其终浓度为 3 mM。

3 向另一个试管（活化细胞）中加入 PMA、离子霉素和莫能菌素，最终浓度分别为 10 ng/ml、2 mM 和 3 mM。

4 在 37°C 和 5% CO2 的气氛中孵育 2–4 小时。

5 在孵育期结束时，将 100 μl 样品等分到适当数量的试管中。

6 在此阶段添加细胞表面抗体（如果您的实验需要）并孵育 15 分钟。

7 每管加入 100 μl LeucopermTM Reagent A 并孵育 15 分钟。该试剂将细胞固定在悬浮液中。

8 用含有 0.1% 叠氮化钠和 1% BSA 的 PBS 洗涤两次。

9 添加 100 μl LeucopermTM Reagent B（渗透细胞）和所需的抗细胞因子抗体。

10 孵育 20 分钟。

11 使用 PBS 缓冲液洗涤两次，并通过流式细胞仪进行分析。

6. 细胞内抗原的直接染色

细胞内抗原的检测需要在染色前进行细胞通透步骤。

1 收获细胞并确定存在的总数。

2 在洗涤缓冲液（含有 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS）中洗涤两次。

3 如果需要，在此阶段使用适当的直接偶联单克隆抗体对细胞表面抗原进行染色。染色后，在 PBS 中洗涤细胞一次并丢弃上清液。

4 每 1 × 106 个细胞使用 100 μl在 Leucoperm T M Reagent A（细胞固定剂）中重悬细胞。在室温下孵育 15 分钟。

5 在洗涤缓冲液中洗涤一次。

6 每 1 × 106 个细胞使用 50 μl在 Leucoperm T M Reagent B（细胞通透剂）中重悬细胞。

7 将 50 μl 细胞悬液分装到所需数量的含有直接偶联抗体的试管中。在室温下孵育 30 分钟。

8 在洗涤缓冲液中洗涤一次，然后重悬于 0.25 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS 溶液中。

9 在 4°C 下储存，直到在流式细胞仪上采集，最好在 24 小时内。

7. 细胞内抗原直接染色：甲醇法

甲醇修饰特别适用于检测一些核抗原，如PCNA和Ki-67。藻红蛋白偶联物不适用于使用这种方法检测细胞表面抗原。

1 收获细胞并确定其总数。

2 在洗涤缓冲液（含有 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS）中洗涤两次。

3. 如果需要，在此阶段使用适当的直接偶联单克隆抗体对细胞表面抗原进行染色。染色后，在 PBS 中洗涤细胞一次并丢弃上清液。

4 每 1 × 106 个细胞用 100 μl 重悬细胞在冷 (2–8°C) LeucopermTM Reagent A中。在 2–8°C 下孵育 10 分钟。

5 加入 500 μl 冷无水甲醇，涡旋并在 2–8°C 下孵育 10 分钟。

6 在洗涤缓冲液中洗涤一次。

7 每 1 × 106 个细胞使用 100 μl 在 LeucopermTM 试剂 B 中重悬细胞。

8 将 50 μl 细胞悬液分装到所需数量的含有直接偶联抗体的试管中。在室温下孵育 30 分钟。

9 在洗涤缓冲液中洗涤一次，然后在 0.25 ml 0.5% 多聚甲醛的 PBS 溶液中重悬。

10 在 4°C 下储存，直到在流式细胞仪上采集，最好在 24 小时内。

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同花顺

简单说一下~~
1.准备细胞，准备出你需要的细胞的数量，尤其是最好预估一下预期细胞的含量，比如说，百分之十，那么你要多少细胞就要准备更多。
2.消化细胞，胰酶消化，最后细胞溶于培养基还是DPBS都行，最好是培养基，活得比较好。
3.过滤网，除去粘连细胞，防止堵住流式，具体大小要根据流式喷嘴型号和细胞确定。
4.上机。