核酸分离提取的注意事项有哪些？

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核酸分离提取的注意事项有哪些？
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清风寡欲

核酸分离提取是一项关键的实验步骤，直接影响到后续实验的准确性和可靠性。以下是核酸分离提取过程中需要注意的几个关键事项：
1. 样本处理

• 新鲜样本：尽量使用新鲜或妥善保存的样本，避免降解。
  
• 样本保存：如果不能立即处理样本，应将其保存于-80°C（冷冻）或置于RNA保证液中（对于RNA样本）。
  
• 避免反复冻融：反复冻融会导致核酸降解，尽量避免。
  

2. 防止降解

• RNase/DNase污染：使用RNase和DNase-free的试剂和耗材。使用专门的核酸实验器具，定期清洁工作台面和设备。
  
• 手套和防护：工作时佩戴手套，避免手部接触样本和试剂。使用新鲜的、洁净的手套和防护装备。
  
• 处理环境：在无核酸酶的环境中操作，最好在洁净工作台或生物安全柜中进行。
  

3. 试剂和耗材

• 试剂新鲜：使用新鲜或稳定性好的试剂。定期检查试剂有效期。
  
• 耗材选择：使用高质量的试剂盒和耗材，确保核酸的纯度和完整性。
  

4. 操作规范

• 严格按照试剂盒说明书操作：每一步操作都应按照说明书进行，特别注意离心时间和温度。
  
• 避免交叉污染：使用专用的移液器和吸头，特别是避免不同样本之间的交叉污染。
  
• 温度控制：在合适的温度下操作，避免长时间暴露在室温，特别是对于RNA样本。
  

5. 提取步骤

• 裂解充分：样本中的细胞或组织必须充分裂解，以确保核酸完全释放。
  
• 蛋白去除：确保蛋白质和其他杂质被有效去除，以获得高纯度的核酸。使用蛋白酶K或其它蛋白降解酶时，确保其完全反应。
  
• 有机抽提：如果使用有机溶剂（如酚-氯仿）进行核酸提取，确保操作安全，避免暴露。
  
• 离心步骤：按规定的离心时间和速度进行离心，确保相分离和核酸沉淀。
  

6. 洗涤和纯化

• 乙醇洗涤：洗涤步骤使用70-80%的乙醇，确保彻底洗去盐分和杂质。
  
• 干燥核酸：洗涤后的核酸沉淀应充分干燥，但不能过度干燥，以免影响溶解。
  
• 溶解核酸：使用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解核酸，保证核酸的稳定性和后续实验的效果。
  

7. 质量检测

• 浓度和纯度测定：使用分光光度计（如NanoDrop）测定核酸的浓度和纯度（260/280和260/230比值）。
  
• 完整性检测：使用琼脂糖凝胶电泳检测核酸的完整性，确保无显著降解。
  

8. 存储

• 短期存储：核酸在短期内（几天到几周）可以保存在4°C。
  
• 长期存储：需要长期存储时，应将核酸置于-20°C或-80°C，特别是RNA样本。确保冻存时避免反复冻融。
  

通过注意以上这些事项，可以大大提高核酸分离提取的成功率，确保获取高质量的DNA或RNA样本，为后续的实验分析奠定基础。

长长的路

提取核酸类型

根据提取物的核酸类型，核酸提取试剂分为DNA提取、RNA提取和DNA&RNA共提。
单独DNA的提取在实验过程中主要是通过加入RNAse降解样本中的RNA，从而得到纯净的DNA，通常市面上的质粒抽提试剂盒可满足实验需求，在重组DNA研究的克隆载体中运用广泛。
RNA的提取有总RNA的提取和miRNA的提取两种，主要运用于基因表达分析、RNA测序、siRNA合成与功能研究、RNA相互作用研究、其他的分子诊断和生物学研究。
DNA&RNA共提的试剂盒一般运用在基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。


核酸提取方法

过柱法

通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐高pH值洗脱，来分离纯化核酸。
磁珠法

对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米级磁珠。该磁珠能与核酸分子特异性结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。
酚-氯仿提取法

通过酚/氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后，在水相中主要溶解以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是脂类物质，蛋白质位于两相之间。
醇沉淀法

乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来，Na之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用，形成沉淀。
样本的不同区分提取方法

核酸提取中，根据样本种类的不同，通常需要用不同的方式对样本进行处理，才能得到纯度更高的核酸。
常见的医疗样本：血液、动物组织、培养细胞、鼠尾等;这类型样本细胞数量较多，样本成分较为单一，但处理方式也有些不同。


动物组织一般-20℃可保存1-3个月，-70℃长期保存;福尔马林固定时间8-24h内为宜，样本存放时间不宜超过1年;FFPE样本保存温度4℃，建议不超过3年。
血液可使用不同抗凝剂的抗凝管进行采集和保存，避免反复冻融，4℃短期保存3-4天， -20℃下可最多保存2年，-70℃下可长期保存全血、白细胞、血凝块、血清或血浆。哺乳动物的DNA因存在于有核的白细胞中，所以提取前需对无细胞核的红细胞进行分离或裂解。
细胞样本的贴壁细胞则需胰酶消化处理再做收集，悬浮细胞需要离心弃上清。
特殊医疗样本：血清、血浆、鼻咽拭子、痰液、支气管/肺泡灌洗液、腹水、病毒、粪便、FFPE样本等细胞数量较少、成分相对复杂，在采样和保存途中通常需特殊的保存液，抑制核酸酶对样本的降解作用，才能保证实验有较高的成功率。其中FFPE样本需先用二甲苯或矿物油类进行脱蜡处理。
植物样本：分为普通的植物样本和多糖多酚类植物样本。


普通植物样本如小麦、玉米、水稻等存在细胞壁结构、内部还有液泡、叶绿体等细胞器结构，成分相对复杂，提取前应使用液氮研磨，研磨充分同时保证样本处于低温条件下避免DNA降解。
多糖多酚植物样本如水果果肉、植物种子等因内含的多糖与核酸理化性质一致、多酚氧化后易于核酸结合，影响DNA的提取，通常在提取过程中需要用专门试剂对多糖多酚去除后才能得到较高纯度DNA。
微生物样本：则分为细菌样本和真菌样本


细菌样本含有细胞壁，有的还有鞭毛和荚膜，提取前需用溶菌酶做破壁处理，如金黄色葡萄球菌加入一定量的溶菌酶在37℃条件下孵育30min就可完成破壁的处理。
真菌样本存在以多糖为主的细胞壁、细胞内部成分相对复杂，通常也需酶解破壁或液氮冻融或超声裂解再提取核酸。

检验医师

核酸的分离纯化是获得目的基因及载体DNA 片段的基本途径，分离的好坏直接决定了核酸样品的质量。
核酸分离纯化总的原则是要保证核酸一级结构的完整性，防止降解，同时要排除其他分子的污染。因为一级结构是核酸分子最基本的结构，储存着全部的遗传信息，是进一步研究的基础。为了保持核酸的完整性，在提取过程中要注意防止核酸酶对核酸的降解。还要防止化学因素(酸碱等)和物理因素(高温或机械剪切等)引起核酸变性或破坏。制备RNA 要特别注意防止核酸酶的作用，因为核酸酶分布很广，活力很高；而对DNA 更重要的是防止张力剪切作用，因为DNA 分子特别长，容易断裂。
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
②其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；
③排除其他核酸分子的污染，如提取 DNA 分子时，应去除RNA 分子，反之亦然。