免疫荧光怎么做？步骤在这里

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原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。在此基础上又分为两种方法：直接法和间接法。
直接法：将标记的特异性荧光抗体直接加到抗原上，经过一定时间反应，即可结合并显色。
间接法：先用抗原的抗体（一抗）与抗原反应结合，再用荧光标记的二抗（一抗的抗体）与抗原反应，形成抗体-抗原-抗体复合物。
应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、细胞因子、细胞表面抗原、多肽、核酸、受体、神经递质、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
实验步骤
1.样本准备：细胞或薄组织。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2.固定：取适当的固定剂固定样本。一般用4%PFA固定4℃过夜。固定完毕后的样本可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
3.洗涤：PBS洗涤5min*3次。
4.打孔：选择合适的通透剂处理样本，目的是使抗体更容易进入细胞与抗原结合。我们一般使用Triton。
5.洗涤：PBS洗涤5min*3次。
6.封闭：使用封闭液对样本进行封闭，一般1h。
7.加一抗：使用合适浓度的一抗与样本4℃过夜。
8.洗涤：PBS或PBST洗涤5min*3次。
9.加二抗：使用间接法时需要加二抗处理，根据说明书使用合适的浓度，避光处理1h（后面步骤均需避光）。
10.洗涤：PBS或PBST洗涤5min*3次。
11.封片：滴一滴防淬灭剂，封片。可立即观察后暂存4℃尽快观察

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