免疫荧光原理及实验步骤（中科世康生物）

营养师

• 免疫荧光技术是一种在免疫学、生物化学和显微镜技术基础上建立起来的强大技术，其原理主要是利用抗原抗体之间的特异性结合，并通过荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内的特定抗原进行定位和定性的分析。
  
• 该技术结合了抗原抗体反应的特异性和荧光标记的敏感性，具有高特异性、高敏感性和快速检测的特点。
  
•   免疫荧光原理 免疫荧光技术的核心在于抗原抗体反应的高度特异性。
  

• 当抗原与抗体结合时，只要知道其中一个因素，就可以通过反应查出另一个因素。该技术通过将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，形成荧光标记的抗体（或抗原），然后使其与相应的抗原（或抗体）结合，在荧光显微镜下观察特异性荧光反应，从而实现对目标抗原的定位和定性分析。
  
•   实验步骤 免疫荧光实验通常包括以下几个主要步骤：  样本前处理： 细胞样本：洗涤细胞，去除培养基，加入固定液（如4%中性甲醛）进行固定，固定时间根据细胞类型和实验需求而定，一般为15-30分钟。
  
• 固定后，用缓冲液（如PBS）洗涤去除固定液。 石蜡切片样本：经过烤片、脱蜡、抗原修复等步骤，使抗原暴露出来。 冰冻切片样本：在OCT包埋液中进行速冻，切片后进行适当的处理。
  
• 通透：对于细胞样本，使用通透剂（如0.1% Triton X-100）处理细胞，使细胞膜通透性增加，便于抗体进入细胞内与抗原结合。 封闭：用封闭液（如5%空白山羊血清）封闭样本，减少非特异性染色。
  
• 一抗孵育：加入稀释后的一抗（特异性抗体），与样本中的抗原结合。孵育时间根据抗体说明书和实验需求而定，一般为室温1小时或4℃过夜。 洗涤：去除一抗工作液，用缓冲液洗涤样本，去除未结合的一抗。
  
• 二抗孵育：加入与一抗种属相匹配的荧光标记二抗，避光孵育一定时间（如室温1小时），使二抗与一抗结合。 洗涤：去除二抗工作液，用缓冲液洗涤样本，去除未结合的二抗。 染核：加入DAPI等染核试剂，避光孵育一定时间（如室温10分钟），使细胞核着色。
  

• 封片：去除染核试剂，用缓冲液洗涤样本后，滴加防淬灭封片剂，封片后在荧光显微镜下观察并采集图像。 注意事项 一抗和二抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗与一抗的种属要匹配，避免交叉反应。
  
• 从孵育二抗开始，所有操作都应注意避光，以免荧光淬灭导致假阴性结果。 选择合适的细胞密度进行试验，避免细胞过于拥挤或过少导致的染色问题。
  
• 实验过程中需严格控制温度、pH值和洗涤时间等条件，以保证实验结果的准确性。
  
• 以上信息基于免疫荧光技术的基本原理和实验步骤进行了归纳和整理，具体实验步骤可能因实验室条件和实验需求而有所不同。在实际操作中，建议参考相关实验指南和抗体说明书进行。
  

南京中科世康实验室

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