免疫荧光（IF）染色实验报告-石蜡切片

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一、实验器材及试剂
1、 实验器材

名称	厂家	型号
脱水机	武汉俊杰电子有限公司	JJ-12J
包埋机	浙江省金华市科迪仪器设备有限公司	KD-BM
病理切片机	浙江省金华市科迪仪器设备有限公司	KD-2258
冻台	浙江省金华市科迪仪器设备有限公司	KD-BL
组织摊片机	浙江省金华市科迪仪器设备有限公司	KD-P
烤箱	上海精宏实验设备有限公司	PHG-9070A
载玻片及盖玻片	江苏世泰实验器材有限公司	10212432C
微波炉	美的微波电器制造有限公司	MM823LA6-NS
脱色摇床	北京市六一仪器厂	WD-9405A
正置荧光显微镜	OLYMPUS	OLYMPUS BX53
成像系统	OLYMPUS	Imageview
数字全扫仪器	3D Histech	Pannoramic SCAN

2、 主要实验试剂

试剂	厂家	货号
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司
二甲苯	国药集团化学试剂有限公司
二抗羊抗兔(fitc)	abcam	ab7086
柠檬酸（PH6.0)抗原修复液	武汉云克隆科技股份有限公司	B008
PBS缓冲液	武汉云克隆科技股份有限公司	B006
双氧水	国药集团化学试剂有限公司	10011208
吐温20	国药集团化学试剂有限公司	30189328
DAPI	ABCAM	Ab285390(2ug/ml)

二、组织石蜡包埋切片实验步骤
1、取材：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
2、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精1h-85%酒精1h-90%酒精1h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。
3、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
4、切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。 切片漂浮于摊片机40℃ 温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

三、 免疫荧光染色实验步骤
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ30min-二甲苯Ⅱ30min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。大火3min，停火10min, 转为低火3min, 此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复强度根据组织来确定）
3、封闭：石蜡切片入PBS中3min*3次，每张切片加入200ul的5％BSA封闭30min。
4、一抗孵育：用PBS稀释一抗到合适浓度，每片滴加50ul一抗，4℃孵育过夜。
5、二抗孵育：切片从冰箱取出复温20-30min,PBST洗涤3次，用1％BSA稀释FITC标记的二抗，每张切片滴加50ul的二抗，37℃烘箱孵育半小时。
6、复染DAPI:PBST洗涤3min*3次，加入稀释好的DAPI,室温孵育10min.
7、封片镜检：每张切片滴加适量的抗荧光淬灭剂盖上盖玻片，荧光显微镜观察，或者全扫仪器全扫。
染色结果：DAPI染核为蓝色的荧光，阳性部位为绿色的荧光。

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