细胞培养的基础知识

生物科研实验室

细胞实验是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能，进而完善相关实验的过程。存在证据等级低的劣势，但由于其来源容易获取、有细胞特异性及实验周期短、成本低等特点，被广泛应用于实验中。需要无菌无毒细胞培养环境、恒定的细胞生长温度(37°C)、合适的气体环境(溶氧和二氧化碳)、适宜的pH及合适的细胞培养基和血清。
细胞的类型
根据细胞的来源（1）原代细胞(primary cell)：直接从体内取出的细胞、器官或者组织分离出的第一代细胞。更接近于细胞的在体状态和特性，但获取及培养均较难。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。（2）细胞系(cell line)：是由原代细胞经传代成功后即为细胞系。细胞系泛指一般可能传代的细胞，其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。（3）细胞株(cell strain)：通过选择法或克隆形成法从原代培养细胞中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。一般认为，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。根据生长方式
（1）贴壁细胞（2）悬浮细胞（3）半贴壁半悬浮细胞正常细胞形态较好，轮廓清晰，边缘透亮，细胞增殖状况良好。当贴壁细胞长到密度90%时，需进行传代。
细胞培养的原则
无菌原则1.操作台环境无菌：紫外线消毒至少30分钟，75%酒精擦拭。2.实验材料无菌：紫外线照射、酒精擦拭、酒精灯、封口膜。3.实验时手部无菌。4.实验操作无菌。减少细胞环境扰动原则1.培养箱内温度恒定，进行操作前培养基预热。2.转移细胞时需轻拿轻放、避免震动。3.缩短细胞在培养箱外的时间，维持恒定的CO2浓度。4.枪头吹打时要轻柔，避免细胞发生破坏。
维持细胞生长的试剂
1.基础培养基：必需成分为氨基酸、维生素、无机盐、缓冲体系。2.血清：作用为提供必须的营养物质及生长因子和促进细胞贴壁。常用的为胎牛血清(剖宫产而出、不含有抗体及补体等成分)、新生牛血清(出生后24小时内)、小牛血清(出生后10-30d)。使用浓度一般为5-20%，最常用是10%。优质血清的标准通常是透明或淡黄色，无沉淀物及病原体污染。血清的灭活条件为56 ℃ 30分钟，去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用;但会损失一些对细胞有利的成分， 如生长因子。饥饿处理：使细胞分裂同步化(停在G0期)，增加细胞间的同质性，在干预实验时促进细胞对药物的吸收。首先使用含血清培养基使细胞贴壁，然后换液为无血清培养基、持续6-12小时，开始干预给药。3.抗生素：依据实验情况明确是否加用，最重要的还是从各方面避免污染、避免污染、避免污染!
新手常见问题解答
1：要怎么样复苏细胞?答：细胞复苏需要准备一个37℃水浴锅、手套、镊子，以及防护眼镜。戴上手套，用镊子夹住液氮罐中拿出的冻存管，然后快速在37℃水浴锅里融解细胞。防护眼镜可以防止液氮罐里刚刚拿出来的管子液氮爆炸。2：培养基不够用，我能不能换一下细胞培养基啊?答：不能，更换培养条件，细胞可能无法快速适应，导至细胞死亡。3：那能不能换血清呢?答：尽量换同一批次的血清，毕竟不同批次的血清，质量不一样，所以可能会有潜在的影响。4：复苏后应不应该立马去除掉DMSO?答：有一些细胞会对DMSO敏感，一般的培养条件来说，复苏后的细胞(含有DMSO)加入完全培养基后培养，一天后再换液，可以避免复苏后细胞的生长和粘附的问题。5：什么时候需要换液?答：这个要根据细胞的生长状态来定，当细胞代谢加快后，应该换液。细胞密度增大后，需要考虑传代。6：培养基到底要不要加抗生素?答：其实是不推荐加抗生素的，但是很多时候，都会为了保险，加上双抗。但双抗只能抗细菌，不能抗真菌!7：啥时候用5%的CO2，啥时候用10%的CO2呢?答：主要看的是培养体系，培养基的缓冲体系基本上都是用碳酸氢钠缓冲体系的，培养基里的碳酸氢钠的浓度决定了CO2的量，当碳酸氢钠达到3.7g/L的时候，需要采用10%的CO2，当碳酸氢钠达到1.5g/L的时候，需要用5%的CO2。如果你用的培养基用的是Hank's balanced salt solution (HBS，Hank缓冲液)的话，就不能用CO2培养箱了，因为这个体系里碳酸氢钠浓度只有0.35g/L。8：培养基在冰箱里的时候，紫红色的培养基为啥会变暗?答：培养基没有密封好保存，因为冰箱里没有CO2补充，培养基变成碱性，颜色就暗了。9：支原体污染是否能肉眼识别?答：支原体用肉眼基本很难判别，主要还是通过PCR检测或者是染色检测来区分支原体污染与否的。10：细胞离心的话要怎么离心?答：推荐1000rpm离心5-10分钟，这样比较不容易伤害细胞。11：复苏后的细胞死亡率高是啥原因?答：1)培养基质量差，2)血清质量差，3)复苏后立马离心，导至大量细胞原地爆炸，3)细胞长时间放置在-80℃，4)误把悬浮细胞当做是死细胞。12：培养基里L-谷氨酰胺是干嘛用的?答：L-谷氨酰胺的主要作用是在培养细胞的能量来源，参与蛋白质合成和核酸代谢。13：培养基里的酚红是干嘛用的?答：酚红一般作为培养基中pH值的指标：当培养基呈中性时为红色，呈酸性时为黄色，碱性时为紫色。另外，酚红可以模拟类固醇激素(特别是雌激素)的作用。如果要避免类固醇反应，可以在无酚红的培养基里进行培养。14：胰酶里为啥要加EDTA?答：二价的离子会抑制胰酶活性，加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg这样的二价离子，另外注意胰酶也不要反复冻融!