做定量 PCR 为什么要提取 RNA 而不是 DNA？

青草

做定量 PCR 为什么要提取 RNA 而不是 DNA？
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长长的路

定量PCR(qPCR)是一种在PCR反应中实时监测核酸扩增产物的方法。到底使用RNA还是DNA?
RNA更能反映gene的表达水平

依据中心法则，细胞内的DNA序列首先被转录成RNA分子，特别是信使RNA(mRNA)，随后mRNA携带遗传信息，用于指导蛋白质的合成。mRNA的丰度和多样性是衡量基因表达水平的关键指标，它们直接关联到特定基因在特定时间和条件下的活性。与蛋白质相比，RNA的水平变化能够更快地反映基因表达的动态变化，因为RNA的稳定性相对较低，其水平变化可以迅速响应细胞内外部环境的改变。通过测量mRNA的表达水平，科研人员可以获得细胞在特定时刻基因活性的快照，这对于理解复杂的生物学过程和疾病机制至关重要。所以，当我们需要对基因表达进行定量的时候，RNA相比DNA更有优势。


DNA序列信息相对稳定

DNA序列是生物体内遗传信息的稳定存储形式，它包含了构成生物体所有基因的核苷酸顺序。DNA分子的数量在细胞中保持相对恒定，仅在细胞分裂过程中进行复制，以确保遗传信息的准确传递给子代细胞。然而，DNA的这种稳定性也意味着，单纯测量DNA的量并不能直接提供关于基因在特定时刻的活性状态或其表达活性的信息，但是当我们测量基因突变等应用的时候，DNA就是一种很好的样本类型。
为什么qPCR不直接扩增RNA?

RNA的不稳定性：RNA分子比DNA分子更不稳定，更容易被细胞内的RNA酶降解。直接扩增RNA可能会增加其被降解的风险，导致实验结果的不准确。
逆转录过程：在qPCR中，通常首先使用逆转录酶将RNA转换成cDNA(互补DNA)。这样，RNA的不稳定性不再是问题，并且cDNA的稳定性和DNA的扩增效率使得实验更为可靠。
实验简便性：逆转录生成cDNA后，可以使用标准的qPCR协议进行扩增和定量，这简化了实验流程并提高了操作的一致性。
避免干扰：直接扩增RNA可能会受到RNA二级结构的影响，这可能会阻碍引物的结合和聚合酶的活动。通过逆转录成cDNA，可以减少这种结构对扩增过程的潜在影响。
提高灵敏度和特异性：cDNA的合成还可以提高qPCR的灵敏度和特异性，因为cDNA的合成可以包括去除原始RNA模板的步骤，这有助于减少扩增过程中的背景噪声。
技术兼容性：逆转录产生的cDNA可以用于多种下游应用，包括qPCR、克隆、测序等，这增加了实验的灵活性。
定量准确性：通过逆转录生成cDNA，可以更准确地对RNA分子进行定量，因为cDNA的扩增效率通常比直接扩增RNA更为一致。

长长的路

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继续前进

既然是定量PCR，那肯定是为了检测某个基因转录数量水平，DNA是基因组，只在细胞进行增殖的时候才会加倍出现，但是我们要测的是某一个基因。基因需要 DNA片段转录成RNA才能表达，所以用某一个时刻的实验材料提取RNA，就能得到那个时刻的总RNA的量，包括你研究的目的基因转录成的mRNA的数量。但是RNA是做不了PCR反应的，那就只能把总的RNA反转录成cDNA 然后以它为模版，进行扩增得到目的产物。
但是，由于单纯的PCR 无法准确知道这个基因具体的转录水平，所以引入了荧光基团，通过收集荧光，计算荧光值来检测基因转录的水平。为了校准和比较，还需要引入内参基因进行定量。
当然，定量PCR有相对定量和绝对定量两种，相对定量一般只知道基因在不同样本或处理中的比值，而绝对定量是通过已知的某个基因的拷贝数作为内参基因，从而得到研究基因的具体拷贝数。

继续前进

看你的标题的话，我猜你是为了检测某基因的表达量才去做的定量PCR。
既然是想要看基因的表达量，那么我们要明确几个概念。
1.特定细胞的DNA含量大致是相同的。所以如果你用相同量的细胞来提取DNA，排除技术因素导致的损失，那么提取到的DNA量也是基本相同的。基因组又都一样，那么如果提取DNA的话是没有办法检测目的基因的表达量的。
2.有很多基因在基因组里有不同的copy数。就是同一个基因可能在染色体DNA里有多次重复。这种基因确实定量PCR会多，但是除了特殊用途，几乎没啥意义。而且用这种方式检测copy数也非常粗略，影响因素太多，无法作为参考。
3.DNA表达量高，首先这个基因就会被大量转录成mRNA。所以如果提取mRNA后再进行逆转录成DNA的话，那么就可以通过定量PCR来分析mRNA的量，从而反映出基因的表达量。
4.定量PCR需要有内参照，也就是在提取总RNA并转录成cDNA之后，设计另一个表达量比较恒定的基因作为参照，来对比目的基因到底表达的多还是少。因为没有这个参照的话，只看PCR出来的绝对值是没有意义的。这个内参照通常用β-actin或者tubulin之类的，构成细胞骨架的蛋白质。
<hr/>另外鉴于某会瞬移教书的抖机灵答主 @黄鼠狼精Morrica 歪了个楼。这里提醒下各位“大专生”，以后上课好好听课，否则大人家觉得你只配上大专。这样的问题只有大专生才问的出来！另外，正常情况下跑基因组DNA也很难检测出准确的copy数，只能跑出一个非常粗略的相对值。

清风寡欲

定量PCR的模板既可以是DNA，也可以是RNA，具体看实验目的。
一般检测细胞中某个基因的表达时，需要提取RNA。这是因为真核生物的基因是断裂的，即内含子+外显子的组成模式；而编码蛋白的序列一般情况下是由该基因的所有外显子组成的，这就需要用基因的全部外显子作为模板进行扩增，所以需要提取RNA之后进行反转录，将mRNA（编码蛋白质的序列）全部变为cDNA，最后利用特定引物进行特定基因的定量PCR检测。
另外也有使用DNA作为模板进行的定量PCR，如检测端粒的长度，是使用基因组DNA作为模板进行定量PCR的。