合格的 pcr 实验如何设计？

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合格的 pcr 实验如何设计？
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检验医师

1. PCR实验室建设标准及规范
《实验室生物安全通用要求》国标GB19489-2008
《室内空气质量标准》GB/T18832002
《洁净厂房设计规范》GB50073-2013
《洁净室施工及验收规范》GB50591-2010
《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011
《病原体微生物实验室生物安全管理条例》卫生部（2004-11-12）
《洁净室及相关受控环境-生物污染控制》ISO14698
《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫医发[2002]8号文
《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号文
《临床基因扩增检验实验室设计标准》卫医发[2002]10号文附文
《基因检验实验室技术要求》国家质量检验总局SN/T1193-2003

2. 功能分区
PCP实验室一般分为四个独立的实验区：试剂制备区、样本制备区、核酸扩增区以及产物分析区，四个分区可根据具体实验内容合并增减。每个实验区须设置缓冲间。也可设PCR专用走廊，走廊内利用压差组织流线。

3. 工艺流线
①人流：人员通过缓冲间分别进入各自实验区域，进出各个实验间需在缓冲间更环洁净工作服以及手消毒等。
②物流：单向物流。在试剂准备区与标本制备区、标本制备区与PCR扩增区之间，以及扩增区域和纯化区之间设计有电子连锁不锈钢传递窗，以单向进行试剂、标本等物品传送，配制的试剂通过单向传递窗由试剂准备区传递到标本制备区，处理过的标本通过单向传递窗由标本制备区传递到PCR扩增区，按照工艺流程逐次传递，避免返流。单向物品传送系统既保障了标本试剂不受污染，又保障了标本试剂不污染环境。

4. 环境设计
①压差：PCR实验室为负压洁净室。按照试剂单向流向，各个实验室之间设计不同的压力，形成压力梯度来实现气流的单向组织。因此，试剂制备区设定为正压（20Pa）或者常压、标本制备区设定为常压或者负压（-10Pa）、核酸扩增区为负压（-10Pa或-20Pa）、产物分析区为负压（-20Pa或-30Pa）。
②墙面与地面：墙面主要采用彩色彩钢板。房间内的所有内角和外角均由铝合金R50内圆铝条制成。地面采用PVC卷曲地板或自流地板。
③照明：照明灯应为纯净灯，以达到易于清洁、无灰尘堆积的特点。

5. 实验设备
①试剂准备区：试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂，因此试剂准备区需配有2~8℃冰箱和-80℃冰箱。
②标本制备区：该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。因此，标本制备区配有2~8℃冰箱和-20℃冰箱，以及用来进行核酸提取操作的生物安全柜。
③核酸扩增区：扩增室主要配备PCR实验室的核心仪器是PCR仪。
④产物分析区：该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。

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就俩个，一个pcr体系，一个反映程序，这俩个每一个步骤都正确就没问题。比如你的体系，主要就是模版和你的引物。模版的话建议提rna然后反转cdna扩增，引物的话就设计的时候注意一下不要有错配，发夹啥的。反映程序的话一般你用哪种酶就按照那个说明书去设，然后改一下自己引物的温度就可以。