核酸提取的方法、适用标本与检测项目

笑看风云

核酸提取是从复杂生物样品中分离提取出DNA或RNA分子，以获得纯净的核酸样本。这对众多核酸分析技术具有关键支撑作用。提取纯净的核酸，可以提高后续检测的特异性和灵敏度，去除试验结果中的矩阵干扰。
定量测定核酸浓度，直接反映样本中的核酸含量。提取的核酸可用于PCR、Southern杂交、基因测序等分子生物学实验，以及疾病诊断、生物进化研究、生物多样性分析等应用。



提取核酸类型

根据提取物的核酸类型，核酸提取试剂分为DNA提取、RNA提取和DNA＆RNA共提。
单独DNA的提取在实验过程中主要是通过加入RNAse降解样本中的RNA，从而得到纯净的DNA，通常市面上的质粒抽提试剂盒可满足实验需求，在重组DNA研究的克隆载体中运用广泛。
RNA的提取有总RNA的提取和miRNA的提取两种，主要运用于基因表达分析、RNA测序、siRNA合成与功能研究、RNA相互作用研究、其他的分子诊断和生物学研究。
DNA&RNA共提的试剂盒一般运用在基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。



核酸提取方法

过柱法
通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐高pH值洗脱，来分离纯化核酸。
磁珠法
对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米级磁珠。该磁珠能与核酸分子特异性结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。
酚-氯仿提取法
通过酚/氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后，在水相中主要溶解以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是脂类物质，蛋白质位于两相之间。
醇沉淀法
乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来，Na之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用，形成沉淀。

样本的不同区分提取方法

核酸提取中，根据样本种类的不同，通常需要用不同的方式对样本进行处理，才能得到纯度更高的核酸。
常见的医疗样本：血液、动物组织、培养细胞、鼠尾等；这类型样本细胞数量较多，样本成分较为单一，但处理方式也有些不同。



动物组织一般-20℃可保存1-3个月，-70℃长期保存；福尔马林固定时间8-24h内为宜，样本存放时间不宜超过1年；FFPE样本保存温度4℃，建议不超过3年。
血液可使用不同抗凝剂的抗凝管进行采集和保存，避免反复冻融，4℃短期保存3-4天， -20℃下可最多保存2年，-70℃下可长期保存全血、白细胞、血凝块、血清或血浆。哺乳动物的DNA因存在于有核的白细胞中，所以提取前需对无细胞核的红细胞进行分离或裂解。
细胞样本的贴壁细胞则需胰酶消化处理再做收集，悬浮细胞需要离心弃上清。
特殊医疗样本：血清、血浆、鼻咽拭子、痰液、支气管/肺泡灌洗液、腹水、病毒、粪便、FFPE样本等细胞数量较少、成分相对复杂，在采样和保存途中通常需特殊的保存液，抑制核酸酶对样本的降解作用，才能保证实验有较高的成功率。其中FFPE样本需先用二甲苯或矿物油类进行脱蜡处理。



植物样本分为普通的植物样本和多糖多酚类植物样本。



普通植物样本如小麦、玉米、水稻等存在细胞壁结构、内部还有液泡、叶绿体等细胞器结构，成分相对复杂，提取前应使用液氮研磨，研磨充分同时保证样本处于低温条件下避免DNA降解。
多糖多酚植物样本如水果果肉、植物种子等因内含的多糖与核酸理化性质一致、多酚氧化后易于核酸结合，影响DNA的提取，通常在提取过程中需要用专门试剂对多糖多酚去除后才能得到较高纯度DNA。
微生物样本：则分为细菌样本和真菌样本



细菌样本含有细胞壁，有的还有鞭毛和荚膜，提取前需用溶菌酶做破壁处理，如金黄色葡萄球菌加入一定量的溶菌酶在37℃条件下孵育30min就可完成破壁的处理。
真菌样本存在以多糖为主的细胞壁、细胞内部成分相对复杂，通常也需酶解破壁或液氮冻融或超声裂解再提取核酸。

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