基因组学的测序方法（DNA）

非诚勿扰孟非

上一篇文章分享了转录组学有哪些测序方法，这篇文章，我们分享基因组层次上有哪些测序方法。


1 全基因组测序（WGS）

全基因组测序（Whole Genome Sequencing），目前默认指的是人类的全基因组测序，指的就是把物种细胞里面完整的基因组序列从第一个DNA开始一直到最后一个DNA，完完整整地检测出来并排列好。因此这个技术几乎能够鉴定出基因组上任何类型的突变。这种从头测序和组装通常应用于没有参考基因组可用或可用参考质量较差的生物体。目前方法主要有以下两种。


2 全外显子测序（WES）

在人类基因中大约有180,000个外显子，占人类全部基因组的1-2%，约30MB。人类基因组的蛋白编码区大约包含85%的致病突变。外显子组测序（Whole Exome Sequencing,WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA 序列，然后通过高通量测序，主要识别和研究与疾病、种群进化相关的的编码区及调控区域（Untranslated Regions ,UTR）相关遗传突变的技术手段。结合大量公共数据库提供的外显子组数据，有利于更好地解释变异之间的关联和疾病的致病机理。相比于WGS测序，有以下优势a 高性价比:与全基因组相比，人全外显子组测序覆盖深度更深，数据准确度更高，更加经济高效 b 高测序深度:测序深度可以到达120x以上 c 高通量:满足大量样本多个目标区域的研究 d 高精确度:测序覆盖深度深，数据准确性高且高效。




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3 靶向DNA测序（panel）

靶向重测序即将一组基因或基因组区域分离出来并对其进行测序。主要分为多重扩增子测序和杂交捕获测序两条技术路线。相比于WGS与WES有以下优势 a 深度测序重要基因（＞500×）实现罕见变异的鉴定  b经济高效研究疾病相关基因  c可以鉴定等位基因频率低（低至5%）的变异  d单次检测中实现遗传性突变的可信鉴定。


4 人类线粒体基因组测序

线粒体是真核生物的重要细胞器，编码与自身功能相关的部分基因，参与重要的生命活动。人类线粒体DNA是一个紧凑的双链环状基因组，长约16 kb，基因组具有结构简单、编码区域高度保守、母系遗传、进化速率快、重组率低、拷贝数高等独特特征。目前基于液相杂交探针捕获技术，将mtDNA富集之后进行高通量测序。


5 单细胞靶向DNA测序

单细胞靶向也是分为低通量和高通量的，在这里我们重点介绍一下高通量的技术平台，Mission Bio 的Tapestri平台。Tapestri 平台将细胞与蛋白酶混合，形成单个液滴。然后进行细胞裂解和蛋白酶消化，使DNA可用于后续扩增。接着将含有细胞裂解液的小滴重新装入仪器中，并与条形码小珠和试剂混合，以扩增特定区域，进行建库从而完成高通量测序和生信分析。通量可达10000个细胞，可在单细胞水平检测基因拷贝数变化、单碱基突变、插入缺失及蛋白质表达等；能够揭示肿瘤发展轨迹、克隆结构，鉴定及纯化基因编辑产物等。


6 扩增子测序

扩增子测序是指利用合适的通用引物扩增环境中微生物的16S rDNA/18S rDNA /ITS高变区或功能基因，通过高通量测序技术检测PCR产物的序列变异和丰度信息，分析该环境下的微生物群落的多样性和分布规律，以揭示环境样品中众多的微生物种类及它们之间的相对丰度和进化关系。



不同研究对象的测序序列

16s rDNA测序

细菌的rRNA类型分为5S rRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）；5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16S rRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多 （占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和9个高可变区。其中，V3-V4区特异性好，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择。



细菌16S rRNA基因序列组成及引物选择

18s rDNA测序

真核微生物的rRNA类型包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA；18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其中既有保守区，也有可变区（V1-V9，没有V6区）；可变区体现物种间的差异，适用于菌种水平以上的分类标准。18S rRNA编码基因序列有8个高可变区。其中，V4区使用最多、数据库信息最全、分类效果最好。



真核微生物18S rRNA基因序列组成及引物选择

ITS测序

在真菌中，5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA序列具有较高的保守性；ITS表现出广泛的序列多态性，序列具有种间差异性，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异，ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分为ITS 1和ITS2。ITS序列片段较小（ITS1和ITS2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。



ITS基因序列组成及引物选择

功能基因扩增子测序

具有特定功能的一类微生物，如硝化细菌、反硝化菌、氨氧化细菌、固氮菌等称为功能微生物，功能基因是使功能细菌发挥特定功能的基因，如 nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。功能基因测序：根据待测环境中具有特殊功能的微生物基因序列设计引物，用该引物进行 PCR 扩增，建库后高通量测序。应用场景为 a 研究功能微生物物种差异、分类和丰度；b 与每个采样点的环境因子相结合，同时分析环境因子与功能细菌群落结构的关系；c 复杂环境中的微生物构成研究。



功能基因列表

7 宏基因组测序

宏基因组(Metagenomics)测序：以特定环境下的所有微生物群体的基因组为研究对象，进行高通量测序，将材料中的提取的微生物基因组DNA随机打断成500bp的片段，在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，组装拼接，研究目的为研究微生物种群结构，基因功能活性，微生物之间的相互协作关系，微生物与环境之间的关系，优势为 a 提高物种鉴定的精准度 b 获得低丰度物种（痕量菌群） c 微生物更完整的基因组（无法分离培养的菌）d 获得环境样本中细菌基因组草图（BINNING）。



宏基因组分析流程

8 微生物高通量单细胞基因组测序

Microbe-seq

在单细胞的层面进行微生物的基因组测序，原理与在转录组中的vasa-seq 有点类似，技术原理为1.单个微生物封装在含有裂解液的油包水液滴中；2.液滴中微生物进行裂解/溶菌，再与含有扩增试剂的液滴合并，MDA扩增法扩增DNA；3.与含有转座酶等试剂的液滴合并，DNA被打断且连上测序接头；4.与条形码液滴合并，barcode标识单一液滴中的DNA片段；5.液滴破裂，建库测序。



Microbe-seq流程

SiC-seq具体流程
技术原理为1. 条形码液滴文库的制备：DNA片段（与fragment互补序列＋15bp随机碱基＋P7互补序列） 和油共封装，液滴PCR扩增，放大条形码序列2. 单个细菌与琼脂糖微凝胶封装（22μm）；3.将微凝胶在裂解酶混合物中孵育过夜（消化细胞壁），基因组纯化（在洗涤剂和蛋白酶的混合物中孵育30分钟，溶解脂质并消化蛋白质）；4. 微凝胶单细菌与转座酶以及油共封装，基因组被片段化；5. PCR试剂与条形码液滴融合，再与微凝胶单细菌融合封装；6. 收集液滴进行PCR 7. 液滴破裂，建库测序



SIC技术原理

以上为目前看到的在DNA层次上大家在做的事情，后边看到新的方法会继续今昔补充。

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