分子诊断技术：核酸检测之二——基因测序

病理医师

基因测序是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。
第1代测序
        1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法，随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型，为核酸测序时代的来临拉开了序幕。经典的Sanger测序技术，被称作是测序界的金标准。随着高通量测序技术应用拓展，基因测序技术将不断升级，也将进一步提高占比，成为未来肿瘤检测的主要技术。目前测序市场主流为NGS测序平台。
         原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序
NGS高通量测序技术又称第二代的测序技术，就是对几百万到数十亿的DNA分子一次性实现并行测序。可对一个物种的全部转录组和基因组进行深入、细致地分析。在基因组水平上对未知序列的物种进行从头测序，获得该物种的基因序列，为后续的进一步研究奠定基础；进行参考序列物种的全基因组测序，并在全基因组这一水平之上进行突变位点的检测，发现个体差异的分子变化。
        NGS的原理是在Sanger测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP。通过碱基互补配对原则逐一的添加标记过的dNTP，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机识别、转换，从而生成相应的序列信息。
          经过实验室操作获取序列数据后，还需要进行数据分析。只有通过这一步骤，前面的工作才有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列与参考基因（组）或者相近物种基因组序列进行比对，并进一步分析得到有生物学意义的结果（如BAM、VCF数据）。
           NGS提供了更快、更便捷和更经济的测序手段，使得人类基因组测序已进入千(美)元基因组时代。上述优点不仅体现在样本的制备、操作和数据产生的环节，更体现在其下游步骤（数据分析环节），相应的数据处理和分析的方法更加直观、方便和快捷。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/581675321