CRISPR新型分子诊断技术

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来源：讯识生物
CRISPR应用到IVD，可以称作是一个划时代的诊断技术。目前应用比较多的CRISPR系统有CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12b 、CRISPR/Cas13a、CRISPR/Cas13b等，其中CRISPR/Cas12b剪切系统由中国科学院自主研发，并取得了相关的知识产权成果。
CRISPR /Cas系统
CRISPR是规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的英文首字母缩写，临近CRISPR locus的基因被命名为Cas（CRISPR-associated），两者简称为CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas作为基因编辑系统被应用最早开始于2012年詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）和埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）的发现，她们的研究证明了通过RNA（sgRNA）可精准定位目标基因位点，通过 CRISPR结合蛋白（Cas蛋白）复合物在目标位点进行精确剪切、替换等编辑操作。因为sgRNA可根据目标区域随意调整，使得CRISPR技术具有高度可编程性和灵活性，在科研、育种和疾病治疗方面具有重要的用途，两位教授也因此获得了2020年诺贝尔化学奖。


CRISPR 新型分子诊断技术
CRISPR检测技术源自于CRISPR编辑技术。近几年, Doudna研究团队、张锋团队等相继发现Cas12或者Cas13的CRISPR系统具有反式剪切能力（Collateral cleavage）。他们发现该酶在完成特异性切割靶标的同时，能够非特异性的切割体系中任意的单链DNA或RNA。利用该原理，搭载恒温扩增的基础上，在体系中添加报告分子，当CRISPR/Cas系统识别靶序列时，会切割报告基团，随后对报告基团产生的荧光信号进行测定，即可确定样本中靶基因是否存在。CRISPR/Cas检测系统的精准识别给检测带来了高特异性，持续的剪切给检测带来了高灵敏度，且无复杂的反应温度要求，降低了对检验设备和环境的要求，使得CRISPR检测技术在分子检测显示出巨大的潜力。
除Cas12a或13a外，全球陆续发现有其他Cas系统也具有类似功能，比如Cas 12b系统，同样显示出极高的诊断应用价值。中国科学院周琪和李伟团队成功地鉴定并改造了Cas12b酶，使之成为哺乳动物基因组编辑工具。激活的Cas12b蛋白具有反式核酸酶活性，能够对ssDNA进行切割，同时释放荧光信号，Cas12b介导的DNA检测（CDetection）策略，可以在结合优化的协调指导RNA（tgRNA）时区分单碱基水平的差异，为核酸检测提供了一个高效且实用的平台。


基于CRISPR的POCT技术
POCT，即时检验（Point-of-Care Testing），指在病人旁边进行的临床检测及床旁检测，即在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。分子POCT是结合了分子诊断和POCT的特点，兼具灵敏度高、特异性强，以及即时床旁检测的特点。分子POCT全自动一体化试剂，包括提取、扩增和检测全流程，实现了“样品进-结果出”的检测模式，在临床实践中获得了医院、疾控中心以及基层医疗机构的青睐。
基于CRISPR技术的新型分子POCT诊断试剂，有更快的检测速度，依托于自动化平台或小型化一体机配套的封闭试剂，实现全自动检测。该系统无需依赖常规PCR仪器，仅需要简单的荧光读取系统即可完成检测，也可实现较高通量的检测，满足极少的手工操作需求和极低的生物安全风险，未来有望提升POCT领域的检测水平。


CDetection 技术
一、CDetection技术
CDetection是Cas12b-mediated DNA detection的缩写，由中科院开发的新型CRISPR/Cas系统，它是集Cas12b蛋白、向导RNA、ssDNA荧光报告分子和RPA（recombinase polymerase amplification）等温扩增于一体的DNA快速检测系统。Cas12b蛋白在靶向切割RPA扩增目标DNA后激活ssDNA切割活性，任意切割ssDNA荧光报告分子，从而发出荧光信号。
2019年7月1号，中科院周琪、李伟团队在Genome Biology上在线发表了题为CDetection: CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity的文章。基于团队前期研究发现的Cas12b能够适应较广温度（25~60℃）和pH（1~8）的稳定性，CDetection系统相较Cas12a-DETECTR系统具有更高的灵敏度，可以实现亚aM（10-19 M）的DNA检测；同时，通过tgRNA（tuned gRNA）的引入，CDetection可以实现单碱基的区分。利用CDetection系统，能够快速地实现细胞、血液、尿液以及动植物中的细菌和病毒感染、基因分型以及SNP突变检测，该技术具有良好的检测灵敏度和特异性，在分子POCT应用领域具有极高的潜力。


二、 CDetection检测新冠原理
目前，基于CRISPR/12b系统的新冠病毒诊断试剂已经开发完成。利用CRISPR反式切割原理，针对SARS-CoV-2病毒设计特异性等温扩增引物和小向导RNA（sgRNA），同时在单链DNA探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记淬灭基团，探针完整时不释放荧光信号，被切割后产生荧光信号。SARS-CoV-2病毒RNA基因组经过反转录及等温扩增反应后得到靶DNA，靶DNA被Cas12b蛋白-sgRNA复合物识别后，激活Cas12b蛋白的反式核酸酶活性对DNA荧光探针进行切割，释放荧光信号。因此荧光检测仪可根据检测到的荧光信号计算差值，该信号的强弱即可指示目标核酸的存在，实现病毒的检测。


三、创新的CRISPR一步法检测技术
通过自主深度技术优化，突破了恒温扩增与CDetection反应无法在一个液体体系里兼容的技术瓶颈，实现了通过单次的加样，单管完成恒温扩增与CDetection反应，15min内能检测出150拷贝/毫升的病毒RNA。由于不需要对扩增产物进行进一步的开盖处理，同时Cas蛋白对靶核酸进行顺式切割，在反应体系中切除恒温扩增反应产物，直接避免了过度扩增的产物气溶胶产生，大大降低了对核酸检验中PCR负压环境的要求，是低成本快速核酸检测的理想技术。



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