如何从-80℃冻存的抗凝全血中提取RNA

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众所周知，RNA容易降解，所以一般提取RNA都会使用新鲜的样本，如果新鲜样本不能立即提取RNA，应立即放到-80℃冻存。如果后续想要再用这个样本，那如何从-80℃冻存的抗凝全血中提取RNA呢？
虽然这个问题不常见，但也有不少人遇到这个问题，有在网上发贴求助的、有直接来向我咨询的，值得讲一讲。首先我们从这个问题看到的另外2个问题：

1. 血液直接冻存到-80℃再提取RNA是个大问题,即使我们查找著名的核酸纯化试剂盒公司QIAGEN的网站，也找不到从-80℃冻存的血液中提取RNA的方法。
2. 血液不加任何试剂直接冻存在-80℃时，RNA会降解吗？如果会降解，多久会降解完？

第一个问题主要是市面上主要的血液RNA提取试剂盒（比如QIAGEN）用到的原理是将白细胞与其它组分分离（用红细胞裂解液去除红细胞）再提取其中的RNA，但我们知道血液中的红细胞不含有RNA，提供RNA的主要是白细胞。 一旦血液经过冷冻就会出现溶血现象，这时所有的细胞都发生破裂，已经无法分离白细胞了，只要使用这种方法（用红细胞裂解液去除红细胞）自然也就提不到RNA。

我研发的全血总RNA试剂盒（总感觉有自夸的嫌疑），是无需用红细胞裂解液分离白细胞的，是直接从全血中提取RNA的。那么是不是能从冷冻的抗凝血中提取到RNA呢？我们做了一个实验测试，从-80℃冻存的全血中提取RNA，结果非常完美。实验设计及相关数据如下：

实验材料：

-80℃冷冻75天的抗凝全血；预先按500 µl血样比1 ml Buffer L9的比例加入Buffer L9的同一个抗凝全血样本作为对照组

（备注：Simgen 全血总RNA试剂盒中的Buffer L9与抗凝全血预混后可在-20℃长期冻存，RNA不会降解）。

实验试剂：

全血总RNA试剂盒（simgen，Cat.No.5201050）
cDNA第一链合成试剂盒（simgen，Cat.No.7306025）

2×SYBR Green PCR Mix（simgen，Cat.No.7106100）
人β-actin引物（Forward：TGACGTGGACATCCGCAAAG/
Reverse：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG）

实验方法：


1. 分两组进行对比实验，每组各做两管：第一组取2个2 ml离心管，各加500 µl新鲜全血，编号1、2；

第二组加入500 µl新鲜全血后再加入1 ml Buffer L9，混合均匀，编号3、4。将两组样本置于-80℃冻存，冻存75天。

2. 75天后取出后置于室温，待血样全部融化后，向1、2中加入1 ml Buffer L9混合均匀；
3. 13000 rpm离心10分钟；

4. 吸取700 µl离心上清转移到装有500 μl无水乙醇的1.5 ml 离心管中混匀；
5. 分两次将混合液转移到核酸纯化柱中，离心去滤液；

6. 依次用500 µl Buffer WA和700 µl Buffer WBR各洗涤一次；
7. 用50 µl RNase-Free Water洗脱RNA；

8. 在微量紫外分光光度计上测量RNA的浓度；
9. 琼脂糖凝胶电泳；

10. 逆转录制备cDNA；
11. 取5 μl cDNA模板进行RT-PCR检测。

实验结果一：RNA浓度


在微量紫外分光光度计上用RNase-Free Water调零，测量洗脱下来的RNA，结果如下，



表一

从表一的数据上可以看出两种方法处理的抗凝血经过75天的长期保存后均提取出了RNA，
且浓度并无太大差异。


实验结果二：血液RNA电泳



在1%的琼脂糖凝胶上，加入8 μl血液RNA，电泳15 min，结果如下，



图一：琼脂糖凝胶电泳图

M：DL 2000 Ladder DNA Marker

1、2：500 μl冷冻抗凝全血提取的RNA
3、4：500 μl抗凝全血加1 ml Buffer L9预先混合后提取的RNA

从图一所示的电泳图中可以看出，四个样本的电泳条带都很清晰。

实验结果三：荧光定量PCRβ-actin基因检测结果



荧光定量PCRβ-actin基因检测结果如下图



图二：RT-PCR曲线（Delta Rn vs Cycle）

阳性：血液总RNA（50 ng/μl）    1、2：500 μl冷冻抗凝全血中提取的RNA

阴性：无菌超纯水      3、4：500 μl抗凝全血加1 ml Buffer L9预混对按照
从图二可以看出，两组不同处理的冷冻全血中提取的RNA经逆转录后获取的cDNA在RT-PCR检测中几乎与阳性同时起线，且Ct值较靠前。

从本次实验可以得出结论：


1、由于使用的Simgen全血总RNA试剂盒不需事先分离白细胞可以从血液中直接分离纯化总RNA，自然也不怕冷冻血液溶血，所以可以从-80℃冻存的抗凝全血提取RNA，结果影响不大。

2、本次实验测试，一次可以从500 μl -80℃贮存75天的冷冻全血中提取到3 μg左右的血液总RNA，且纯度很高，完全满足后续基因检测的需要。

3、抗凝全血在-80℃冻存时间小于75天的，提取到的RNA尚未观察到有严重的降解。

4. 解冻后的抗凝全血立即用Simgen全血总RNA纯化试剂盒提取RNA，即使不加RNA酶抑制剂，RNA也不会被降解。

好了，这就是我说的实验结果非常完美。如果你也遇到提取DNA或提取RNA的疑难杂症欢迎交流，研究技术是一件很享受的事。

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