Western-Blotting 详细步骤、注意事项【干货】

大v

一、制胶（用三蒸水）
1、夹板检漏：薄外厚里，厚板上宽下窄，加二蒸水检漏，然后在不动板的情况下倒掉二蒸水。
2、侧放整个夹板，用滤纸吸干二蒸水。
3、配制分离胶（蛋白分子量越大，胶的百分比越小。后两个是促凝剂，加完以后尽快加入胶板），将分离胶加到距离绿线约0.5cm处。
4、用异丙醇压平胶，20min左右。
5、配制浓缩胶，剩下两种促凝剂，倒掉异丙醇，用滤纸吸干异丙醇，配制完浓缩胶，将浓缩胶注入胶板，需静置20min左右。
6、快速将梳子插入胶板，不要产生气泡，如果有气泡产生就上下提梳子，把气泡赶走。
7、若不能立即使用，应当将胶用塑料膜包裹放入红色餐盒，再放入4℃冰箱保存。
注：制胶试剂，APS过硫酸铵是储存在-20℃，10%SDS是储存在常温，其余都放在4℃冰箱。
二、制取样本（制取样本方式多样，这里是贴壁细胞蛋白制取方式）
1、用真空泵吸去培养基，用1mlPBS清洗
2、用加入裂解液150ml（配置方法：1.5 ml 2.5×loading buffer10ul、1ml ddH2O、25 ulβ-巯基乙醇）用枪尖将样本混至糊状，放入EP管中
3、将样本放在100℃下煮20min。若不能立即使用，将样本保存在-20℃的冰箱，要使用前先放入仪器，化开样本。
三、跑胶
1、拼装电泳设备，先将两板拼接，再往中间倒入1×SDS-PAGE，不漏液，轻轻将梳子垂直拔出。
2、经合理设计后将样本注入胶中。（1×loading buffer10ul、样本10ul、marker3ul）1×loading buffer的作用是防止样本跑歪，枪尖与界面倾斜一点加入样本。
3、将板放入盒中，继续倒1×SDS-PAGE
4、盖上盖子（红对红，黑对黑）开始用80V的电压，跑至分界线时改为120V的电压，跑1.5h左右，跑至样本完全超过marker的绿色部分（注：板拼接后不能漏液，液体要完全布满两板中央）
四、转模
1、在铁盘中用转模液浸泡材料，膜上不能留泡沫
2、剪一块大小合适的PVDF膜，在小塑料盒中倒少量甲醇，将PVDF膜剪下一个角（右上角、区别正反）并用甲醇浸泡
3、小心切割胶，选择所需要的部分，左右保留样本和marker，要切去溴酚蓝，膜最好比胶小。
4、将胶转移至滤纸上（注意平放），将PVDF膜附上，膜和胶之间不能有气泡，夹紧板。

黑网	上
滤纸
PVDF膜
胶
滤纸
黑网
黑色负极	下

5、取适量冰袋，蓝色冰袋放入盒中，其余冰袋放入盆中，盒放入盆中。盖上盖子，红对白黑对黑，黑板对黑、透明板对白。
6、用150A电流转模2小时（小分子量），1.5小时（大分子量）。
五、孵育
1、配5%脱脂乳50ml，奶粉+PBST。
2、用PBST漂洗膜，放于脱脂乳中，摇床室温孵育1h。
3、孵1抗
（1）配制一抗液稀释液（10ml、5%BSA+PBST），然后在一抗液中加NaN30.1ml。然后根据说明书稀释一抗，不同抗体比例不同。
（2）用PBST漂洗膜
（3）用保鲜膜将膜包裹，切下要孵育的片段
（4）用塑封膜将膜封上，留一个口
（5）用镊子分开一条缝，加入相应的抗体400ul，赶走气泡，密封（机器功率调至1）
（6）放在旋转培养器上，置于4度中孵育过夜
4、孵2抗
（1）用PBST漂洗膜，摇床摇5min，重复3次
（2）在第三次漂洗的时候配制二抗（注意看是鼠抗还是兔抗，二抗放在蓝色盒子里）脱脂乳：2抗=可以达到10000:1  2抗一般加1ul 每条带需要大概1.5ml二抗
（3）将条带泡在二抗中摇床摇1h（室温孵育），将条带的正面贴在脱脂乳上
六、显影
1、配制显影剂（1:1各取80ul）
2、用PBST漂洗膜，摇床摇5min，重复3次
3、显影，如果不能及时显影，就用PBST保存在4℃

实验室条件不同，一些步骤可能会有一些差异。
个人经验，如有错误，望批评指正！！！欢迎大家交流。

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