Western Blotting--ECL发光法

奋斗的小鸟

​什么是Blotting？
印迹（Blotting）是将大分子(蛋白质，核酸等)从凝胶转移到固定膜的固体表面以检测已转移的分子的过程，Western blot是一种使用特定抗体来识别凝胶电泳分离的蛋白质的技术。
什么是Western Blotting？  
蛋白质印迹(Western Blotting)原理为利用电泳分离蛋白质，接着将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法，通过分析条带大小和显色信号获得目标蛋白质在所分析的细胞或组织样本表达情况的信息。做WB实验时，ECL发光液对于实验的成功非常重要。如何选择一款适合自己实验的ECL发光液，对我们实验将会起到事半功倍的效果。
一、ECL的发光原理：
ECL（enhanced chemiluminescence）发光液是基于鲁米诺（Luminol）的新一代增强型化学发光底物试剂，即辣根过氧化物酶（HRP）化学发光底物液，是目前WB检测中最常用高灵敏的显色试剂。ECL试剂的核心原理为氧化反应发光：一般使用的发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，被H2O2氧化生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光，光子信号可通过X射线胶片或CCD成像仪被捕获。
注意：在发光过程中HRP只是起催化作用，不需要消耗HRP,所以只要HRP没降解失活，是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶，在室温放置时间过长，是会降解的；同时在发光过程中有什么物质（比如显影液）污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。
鲁米诺作为发光底物的主要成分，在碱性条件下，通过辣根过氧化酶（HRP）催化，。这个过程被发光增强剂加强。其中，增强剂在体系中扮演着核心角色，决定着ECL 化学发光的发展。





ECL发光原理



反应原理


  随着大量科学家对增强型化学发光的研究，出现了一系列增强剂和氧化剂。
增强剂主要分为五种，分别是：1、苯胺类化合物，2、苯酚类化合物，3、噻吩嗪类化合物，4、吡啶类化合物，5、硼酸类化合物


1.1 苯胺类增强剂：对甲氧基苯胺，对-羟基-N,N’-       二甲基苯胺，邻苯二胺；
2.1 苯酚类增强剂：对甲氧基苯酚，邻甲氧基苯酚，       4,4-联苯酚，对苯基苯酚，对碘苯酚，对溴苯         酚，对-羟基肉桂酸，6-羟基苯并噻唑；
3.1 噻吩嗪类增强剂：3-（10-吩噻嗪基）丙烷-1-磺       酸钠,10-(2-二甲基氨基-1-丙基)吩噻嗪 ；
4.1 吡啶类增强剂：4-二甲氨基吡啶，4-二乙基氨基       吡啶，4-甲基氨基吡啶，4-(氨基甲基)吡啶，吗       啉，4-吡咯烷基吡啶，4-哌啶基吡啶，4- (4-氨       基哌啶基)吡啶。
5.1 硼酸类增强剂：对碘苯硼酸，对氯苯硼酸，间氯       苯硼酸，3,4-二氯苯硼酸，对溴苯硼酸。
    氧化剂主要分为过氧化氢，过氧化脲和过硼酸钠。

    在增强剂和氧化剂物质作用下，鲁米诺的发光强度可被提高 1000 倍，并且在氧化剂与增强剂共同作用下发光时间也得到延长。目前一般的发光增强剂都可以将发光灵敏度提高1000倍至100000倍以上，可以检测pmol甚至fmol级别，发光的灵敏度已经非常成熟。对于现在来说发光稳定性成为目前研究的重点之一，发光不稳定的增强剂，容易在一些情况下发生“淬灭”，即快速消耗发光试剂，在几秒钟内发强光，又在几秒钟内迅速消逝，出现不容易被检测的现象。
二、ECL发光液的选择
    在选择ECL发光液时，需要同时考虑多个因素：目标蛋白的丰度（高、低）、蛋白样品量（较大、有限）、ECL发光液的灵敏度、实验室可用的检测仪器以及抗体，由此选择最适合实验的ECL发光液。目前市面上ECL发光液主要分为增强型、超敏型、持久型和超高灵敏型，其主要区别在增强剂和氧化剂的不同。
三、ECL发光液的使用
1.常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。
2.最后一次洗膜的同时，新鲜配制发光工作液：分别取等体积的A液和B液(浸泡用量：每1cm2膜需要100~200 μl发光工作液；为节省ECL的用量，可选将ECL工作液滴加到膜上，用量为：0.5 mL发光工作液/5cm*9cm膜），混匀后，转移到清洁的塑料小盒中。【注】：吸取A液和B液时务必更换新吸头。
3.用平头镊将漂洗过的膜取出，将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥，保持膜处于湿润状态。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中，使其完全浸入发光工作液，轻轻摇晃，与发光工作液充分接触。室温孵育3-5分钟，准备立即压片曝光。4.用平头镊子将膜夹起5-10 秒，并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液，留下少量工作液，不可让膜完全干燥。不可洗去发光液。
5.在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上固定于X 片暗盒内。
6.暗房内取一张X光胶片至于包裹的膜上，压片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟，定影显影冲洗。
四、常见问题与解答
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