【Western-Blotting】WB相关buffer配制及SDS-PAGE制备

莺歌燕舞

1、WB相关Buffer配制：
1）NP40裂解液（pH=8.0）：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1% NP-40（市售）；
2）1 M Tris-HCl, pH=7.6 (1000 mL)：121.1 g Tris-Base，8000 mL去离子水（dH2O），用1M盐水滴定至pH=7.6，定容至1 L；
3）0.5 M Tris-HCl, pH=6.8 (1000 mL)：60.6 g Tris-Base，8000 mL去离子水（dH2O），用1M盐酸滴定至pH=6.8，定容至1 L；
4）电泳缓冲液（5000 mL）：15.1 g Tris-Base，94 g Glycine，50 mL 10% SDS溶液，去离子水（dH2O）溶解、定容至5 L；
5）5×湿转缓冲液(1000 mL)：29.1 g Tris-Base，94 g Glycine，去离子水（dH2O）溶解、定容至1 L；
6）1×湿转缓冲液(1000 mL)：200 mL 5×湿转缓冲液，200 mL甲醇，600 mL去离子水（dH2O）；
7）TBS缓冲液：6.05 g Tris-Base，8.76 g氯化钠，800 mL去离子水（dH2O）溶解，1 M盐酸滴定pH至7.6，去离子水（dH2O）定容至1 L；
8）0.1% TBST缓冲液：1 mL Tween-20，1000 mL TBS缓冲液；
2、SDS-PAGE胶的制备
大多数实验（小课题组）因使用上述buffer（尤其是配制SDS-PAGE的buffer）的需求相对较小，且国产公司配制的上述液体也较便宜，无需配制。笔者配制浓缩胶的配方如下，和市售或者有的实验室配制的胶的配方稍有出入，但在笔者实验室均使用的下述配方，使用很方便。
1）分离胶（下层胶）配制（10 mL）：


2）浓缩胶（上层胶）配制（浓度为5%，5ml）：


  3）一般来说，7.5ml分离胶+2.5ml浓缩胶即可配制1块SDS-PAGE胶（厚度1.5mm）胶。分离胶和浓缩胶在室温下，大约需20min固定成型。在制备SDS-PAGE电泳胶时，初学者极易制成笑脸型胶，导致WB条带不平，笔者的经验时加完分离胶后，用1ml*头沿厚玻璃板缓慢、匀速、连续滴加ddH2O或无水乙醇，压平分离胶；最好的是液体滴加到厚板上，让液体靠重力落下，切忌将液体朝分离胶方向吹打；有的研究者认为加水压平这一步需要快，但没要求那么快，2min内滴加完成即可，分离胶没那么快凝固。
tips：制胶浓度根据待检测蛋白的分子量而定，网络上参考资源甚多。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/122395330