【Western-Blotting】蛋白提取与蛋白定量

大v

在《WB样品准备》中笔者提到了WB样本（细胞或组织）、蛋白变性及蛋白保存的相关要点。在此，笔者简要介绍蛋白的提取与蛋白定量。
一、蛋白提取
1、蛋白裂解液与裂解环境
现如今，商业化的蛋白裂解有很多中，有强效的、裂解时间短（约5-10min）；也有普通的、裂解时间尚可（约30min）；也有超强效的，裂解时间极短（小于5min）。其中，上述裂解液的裂解环境，一般推荐为冰上或者4℃裂解，减少蛋白降解；而在蛋白裂解液中也推荐加用磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，抑制细胞内酶对蛋白的自然降解。
对于普通蛋白的提取，如实验时间无特殊，选用普通的蛋白裂解液、冰上裂解即可；对于极易受环境影响的蛋白（比如低氧相关蛋白，HIF-1等），研究报道将细胞从低氧培养箱中取出2-3min即可影响HIF-1表达，因此宜选用超强效蛋白裂解液，并在低氧培养箱（37℃）中快速裂解。
2、组织蛋白提取
在组织蛋白提取过程中，一般推荐加用蛋白裂解液（磷酸酶和蛋白酶抑制剂）后，冰上研磨、匀浆化处理组织。组织来源不同，蛋白的产出亦不相同。欢迎各位留言，分享经验，比如1mg组织能产出多少蛋白。
二、蛋白定量
1、蛋白浓度测定
蛋白定量的方法有很多种，应用较多的主要有两种：BCA蛋白定量检测法和Bradford蛋白定量检测法，市售的蛋白定量试剂盒也多基于上述两种检测方法而开发的。两种方法均需配制蛋白标准品，蛋白与定量试剂经过一定时间的反应（BCA法反应为37℃、20-30min，Bradford法反应一般为37℃，5min），酶标仪读取样品的OD值，绘制的蛋白标准曲线，依据标准曲线计算WB蛋白的浓度。两种检测方法笔者均有使用经验，相比BCA法，Bradford法不仅节省反应时间，也无需配置反应试剂，简单、快速、好用，笔者推荐Bradford法测定蛋白浓度。
严格来说，每次的蛋白浓度测定均需配制新鲜蛋白标准品，保证每次测到的蛋白浓度的准确性。然而，WB法评估蛋白表达水平本身就是一种半定量或者相对定量，因此在实际蛋白样本准本及浓度测定时只需保证均一性即可，即使用同样的标准曲线计算同一批蛋白的浓度，如果计算准备即可保证蛋白上样时内参水平基本一致。因此，在实际操作中我们只需测定一次标准品的OD值、绘制标准曲线，即可用此曲线来计算后续实验蛋白的浓度，节省时间和试剂。
具体的蛋白定量步骤，各位朋友参考试剂盒提供的方法即可，简单易行。至于标准曲线的绘制，网络亦可查到不是帖子介绍用不同软件绘制标准曲线，笔者在此不做详细介绍，。如有需要，可本帖留言。
2、蛋白浓度的调平
有研究者喜欢计算添加loading buffer及变性以后的蛋白终浓度和上样体积，然后在蛋白上样时用loading buffer配平，保证上样体积基本一致。而笔者更喜欢用loading buffer和蛋白裂解液调整蛋白浓度到基本一致（一般为1-2ug/ul）以后再变性，如此蛋白上样时只需使用相同体积的蛋白样品即可，笔者经验是这样的方法相对省时且不容易出错。

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