随着 CRISPR 基因编辑技术的流行，ZFN 和 TALEN 还有应用的空间吗？

虎威将军

它们与 CRISPR 相比有什么优势吗？目前的研究情况如何？会被 CRISPR 全面取代而淘汰吗？

ZFN： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术
TALEN： 转录激活因子样效应物核酸酶技术

原文地址：https://www.zhihu.com/question/264974751

队长是我

撰文丨不器
编辑丨于靖
<hr/>ZFN技术的领导者，至少不会在2024年第三季度倒闭了。
8月6日，Sangamo为自己找来新的合作方：基因泰克将支付5000万美元的近期预付款和里程碑付款，外加高达19亿美元的开发和商业里程碑付款、净销售额分级特许权使用费，引进其平台开发基因药物。
对于苦苦挣扎的Sangamo，这无异是根救命稻草。按照此前发布的2024年第一季度报告，这家Biotech的现金仅够维持约半年。
授权消息公布后，Sangamo当天股价最高一度上涨超过50%，然而，危机并未彻底解除。相较于2020年底的最新高位，近95%的跌幅表明，二级市场正在迅速抛弃它。
与之对比，2023年共同推出采用CRISPR技术的基因编辑疗法Casgevy的药企，境况要好得多：CRISPR Therapeutics股价还维持在50美元的水平，Vertex今年以来上涨了15%。更重要的是，CRISPR领域正朝着下一代方向变革，欣欣向荣。
“我们无法对抗30多家CRISPR公司向所有投资者鼓吹这项技术的局面，”Sangamo首席执行官Sandy Macrae说，“但我们确信我们的科学是好的，药物是有效的，我们期待证明这点。”
上述愿景还需要一段时间展现，或者宣告破产。但眼下，基因治疗领域确实迎来了CRISPR的新浪潮。

01 更小的酶：下一代CRISPR疗法

Casgevy走向商业化，标志着一种基因编辑新技术的逐渐成熟——CRISPR，即“成簇的规律间隔的短回文重复序列”。
原核生物在长期演化过程中，利用CRISPR抵抗外源遗传物质的入侵。简单来说，基于此，原核生物能够识别与噬菌体或其他入侵者相匹配的基因序列，然后调动被称作CRISPR相关蛋白（Cas）的酶对其破坏。
2012年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna两位科学家发表论文，CRISPR-Cas9基因编辑系统正式走入产业视野。药企尝试以此治疗各种疾病，十余年后，基于CRISPR技术的Casgevy，最先在镰状细胞病、输血依赖性地中海贫血方面取得突破。
Cas9虽然是一种简单而强大的基因编辑工具，但也有局限性，例如体积较大。
用Casgevy治疗时，需要先提取患者的细胞，在实验室进行编辑，然后重新输回人体。该过程耗时长、效率低、成本高，一个制约因素就是酶。
更小的酶，意味着可以更有效地包装到AAV载体中。斯坦福大学生物工程副教授、加州大学CRISPR专利共同发明人Stanley Qi解释说，在体内应用方面，体积缩小会带来Cas9不具备的优势。
Doudna作为联合创始人的两家Biotech——Mammoth Biosciences和Scribe Therapeutics——都希望克服Cas9在体内应用的局限性。
其中，Mammoth开发的超小型CRISPR系统，体积只有CRISPR-Cas9的三分之一，独特的设计令它可以在原本难以达到的组织进行体内基因编辑。
“Casgevy获批是一个巨大的里程碑，但这需要在体外操作。我们关注的下一步是解决绝大多数遗传疾病，这就离不开全身给药的方式和技术，也是我们认为这些超小型系统将带来变革的地方。”Mammoth首席执行官Trevor Martin介绍说。
Mammoth的系统基于核酸酶应用和双链断裂以外的新模式，包括碱基、逆转录酶和表观遗传编辑。其NanoCas、CasPhi核酸酶体积小，克服了病毒和非病毒载体递送的限制，而后两者正是Cas9等面临的挑战。
4月，Mammoth和再生元达成合作，共同研究、开发和商业化基于CRISPR的体内基因编辑疗法，期待新系统能递送到肝脏之外的组织。根据协议，Mammoth超小型CRISPR系统旨在解决病毒载体递送的大小限制，并补充再生元的靶向AAV技术。为此，再生元将支付包括1亿美元的预付款，并对Mammoth进行股权投资。
再生元并非唯一的入局者。现阶段，Mammoth还与拜耳建立了战略合作关系，甚至在Casgevy尚未获批前的2021年就吸引了Vertex的注意力，达成7亿美元的合作。
这些投资者都希望，利用超小型CRISPR系统开发针对多种适应症的体内基因编辑疗法，尤其是常染色体显性疾病等领域——Cas9由于缺乏足够靶向性而束手无策。
Scribe首席执行官Benjamin Oakes也透露，他们没有选择主流的Cas9。相反，Scribe开发了一种名为CasX的分子，该称呼暗示着这种酶包含多种特质。
“它本质上是一种与Cas9完全不同的酶。它非常小，允许我们使用许多不同的递送工具。”Oakes补充说。
Scribe正在探索一种数据驱动的工程方法CRISPR by Design，帮助它构建与CRISPR-Cas9不同的基因编辑系统，包括改变原间隔序列邻近基序的特异性，使分子更有针对性地靶向具有治疗重要性的特定位点。
2020年，渤健与Scribe签署协议，合作开发治疗肌萎缩侧索硬化症的CRISPR基因疗法，并于两年后扩大合作范围。
另一家尝试在CGT突破的巨头赛诺菲，也从2022年开始跟Scribe一起布局创新。2023年，双方同样加深体内基因编辑疗法的合作。今年1月，赛诺菲行使了第二个目标的选择权。

02 创新“孤勇者”，终被时代抛下？

CRISPR背后的资本涌动，一度也是Sangamo触手可及的盛景。
从时间线来说，基因编辑技术ZFN（锌指核酸酶）的出现，要比第三代的CRISPR更早。1984年，科学家就在非洲爪蟾转录研究中发现了ZFP（锌指蛋白）这种转录因子。经过人工改造，ZFP与核酸内切酶连接组成ZFN。
跟后来的CRISPR类似，ZFN可识别和结合特定的基因序列，并对目标进行特异性切割。众多科研机构就此技术展开优化，但Sangamo却关上ZFN走向大规模产业应用的大门。
1995年，Edward Lanphier创立Sangamo之初，就决定将公司打造成一个外人无法从中“分一杯羹”的技术孤岛。随后，从ZFN设计、优化到临床应用的整套技术体系的专利，都被Sangamo牢牢抓住。
围绕ZFN，Sangamo主要布局了基因疗法、细胞疗法、基因组编辑、基因表达调节4个方面的应用，辉煌时期坐拥几十条研发管线，适应症覆盖肿瘤、神经疾病、肠道疾病、单基因遗传病等大小领域。其中，2023年9月处在临床阶段的项目就有6个。
可是，彼时这家Biotech却没有那么多气力来往前走。事实上，自2023年开年不久，它的股价就长期跌至1美元以下。
2023年4月，Sangamo宣布着手重组，对管线优先级进行调整，并裁员近120人。11月，它再度裁员约160人。重组计划背后，是该公司授权合作上的大溃败。
Sangamo在当年第一季度一连宣布终止与诺华、渤健的合作，这两项合作的开始时间都起于2020年。最初，诺华开出7500万美元预付款和7.2亿美元里程款，希望开发三款基于ZFN的基因疗法；渤健为加强CNS领域，更是承诺了3.5亿美元预付款和23.7亿美元里程款。
值得注意的是，正如上文提及的，渤健在2020年也跟Scribe签署协议。所以，这家MNC最开始的投资，与其说是对Sangamo和ZFN技术路线的有力背书，不如看成将鸡蛋放在不同篮子的“盲选”策略。
更早抛弃Sangamo的巨头，是赛诺菲。2022年1月，两家公司分拆了自8年前就达成的同盟，利用ZFN开发的基因治疗已进入I/II期临床。此后，赛诺菲投入CRISPR阵营的怀抱。
近30年的苦心孤诣，却不想落至“众叛亲离”，这大概是创始人Lanphier所想不明白的故事走向。某种程度上，专利期就是药企业绩的增长线，艾伯维和前任“药王”Humira，便属于市场独占赚得盆满钵满的一个典型案例。不过，该逻辑在新兴的基因编辑赛道，还有其他变量。
业内人士评价，“孤勇者”的形象总是更能引起大家钦佩，然而在人类技术发展史却一再证明，拥挤的智慧比孤独的勇敢更有价值。
Sangamo看似避免CRISPR那样的专利之争，与此同时，却也为这项基因编辑技术的迭代，树立了高门槛。Sangamo的授权往往针对特定的项目和管线，这意味着，前期的基础研究都需要这家一直亏损的Biotech承担。
现阶段，授权模式最有希望的走到终点的，是跟辉瑞合作推进的血友病A治疗项目。7月下旬，这款名为giroctocogene fitelparvovec的基因疗法，在III期临床中达到终点。
辉瑞计划未来几个月内，跟监管机构就此进行沟通，以推动该疗法的获批。最乐观的情况下，Sangamo会从辉瑞获得高达2.2亿美元的里程碑付款，以及14%至20%的销售额授权费——分析师预测，该药物在2031年或2032年达到7亿美元的营收峰值。
此次基因泰克加盟，也让Sangamo的ZFN故事得以有更多讲下去的机会。问题是，这到底是没有根本改善第一代基因编辑技术的生态。
Seeking Alpha发布的一篇文章分析，Sangamo手头还有3项颇具看点的资产，它们将在半年内更新进展，在未来一年到一年半内带来约10亿美元的现金和里程碑收入。作者认为，Sangamo最不可能发生的结果是在2024年底前破产。
但反过来说，如果一家药企以破产作为比较基线，也足够说明其境况的艰难。
Sangamo继续发散着寻找合作方的信号，基因编辑领域的故事还在上演，只是，当人们将ZFN与CRISPR两项技术并列观察，不免会引起对于创新路线结局天差地别的嗟叹。
<hr/>参考资料：

• Roche licenses Sangamo’s technology for another shot at Alzheimer’s drugs；BioPharma Dive
  
• Small Enzymes, Giant Leaps: CRISPR’s Next-Generation Approach to Genetic Diseases；BioSpace
  
• 【药海听涛】孤者不勇：ZFN基因编辑先驱Sangamo连遭厄运；空之客
  
• ZFN基因治疗赛道“孤勇者”：Sangamo的辉煌与黯淡；医药魔方Pro
  
• Despite Late-Stage Hemophilia Win, Sangamo Remains in Do-or-Die Situation；BioSpace
  
• Sangamo Therapeutics: A Bust Or Billion Dollar Valuation In The Remaking；Seeking Alpha
  

卡卡

技术的更新必然向着更简单更有效的方向前进这是基本法！首先，题主，锌指核酸内切酶英文简称是ZFNs，基本单词弄错了显得特别low。第二，TALEN和ZFNs在研究方向上还可能有人愿意拾遗，在应用领域上基本见不到了，涉及到基因定点编辑这块的，Cas9没毛病。原因无非就是我说的更简单，更高效。
“CRISPR/Cas9技术相对其他基因编辑技术的应用优势 在CRISPR/Cas9系统出现之前，ZFNs人工核酸酶与TALEN人工核酸酶是另外两种用于基因定点编辑的技术，CRISPR/Cas9系统与这两种技术相比有明显的技术优势，包括更加容易设计sgRNA、构建与Cas9共表达的表达载体、较高的打靶效率以及在靶位点形成多种突变，更加适用于在多种细胞中进行大规模基因编辑。”
TALEN和ZFNs的基本原理都是在靶位点招募具有核酸内切酶活性的蛋白质来形成DSBs，相比于只在靶位点设计一段sgRNA，剩下的都交给Cas9蛋白来解决的Cas9来说，难度简直就是指数上升的。
第三，对于基因编辑技术来说，Cas9可能也不是终点。说实话，我当初特别期待NgAgo技术真的能实现，虽然结局确实不怎么尽如人意。但是，现在也确实发现了一些类似于Cas9的系统，比如说cpf1(PAM序列是TTTN，效率略低于Cas9)或者是Cas9系统的一些改进版espCas9（低脱靶效应）
总而言之，就这个问题来说,Cas9取代TALEN和ZFNs基本上就是板上钉钉的事儿了。但是，基因编辑技术能发展到哪个高度，这就只能让时间给我们答案了。

感恩由您

最近实验室在开用crispr做突变菌的实验，
因为我后续的项目可能也要做新的突变菌，我也和老师表达了想要用crispr的想法。老师还和我说现在还有一个crispr/cas3用来编辑RNA的…
个人感觉现在很多实验室都在大量的研究这个技术，大家可能会想要把这个技术做成标准，类似western之类。未来一段时间内，拥有这个技术的人，在大部分实验室里都混的下去。

卡卡

看到楼上的回答，心有戚戚，打个比方：
ZFN 前装滑膛步枪（打那指那）
火绳枪图片_百度百科TALENs 前装线膛步枪（指那打那）
肯塔基长步枪图片_百度百科CRISPR 算是后装枪，可以进一步发展出滑膛版（野生型cas9）或线膛版（各种脱靶少的突变体，nickase和 Deadcas9-FokI等）。直接往细胞里导入Cas9/sgRNA 复合体算是定装弹药？不知啥事发明机关枪？哈哈。

继续前进

更新一下，最近有一篇Trends in Genetics的综述文章讨论用CRISPR/Cas9，ZNF和TALEN编辑mtDNA的，还没有细读，看起来CRISPR在这一方面，确实尚有欠缺。https://doi.org/10.1016/j.tig.2017.11.001
===============================个人认为答案是肯定的。粗爆一点，直接上pubmed搜索一下相关文章数量，一目了然。但是这个技术被淘汰了，不代表它没有一点用，毕竟原理不一样。技术在那里，也许有一天发现还有妙用也未知。比如ZNF和TALEN都只需要表达人工改造的核酸酶蛋白就行，不像CRISPR需要RNA参与。如果要修改线粒体DNA，怎么让sgRNA(或者Cas9-sgRNA复合物)进去可能是个问题，但是ZNF和TALEN只需要加线粒体定位序列就可以。TALEN应该是用文章发表过，好像是在Nature Medcine。很久没follow了，不知道CRISPR有没有人尝试过在线粒体里改DNA。
具体CRISPR好在哪，可以说下个人经验。TALEN和CRISPR本人都用过。不论是构建速度，灵活性，还是基因编辑效率，都CRISPR技高N筹。TALEN构建一个靶向16个碱基的位点，需要插入16个几乎完全相近的串联氨基酸模块，每个模块对应一个碱基，所以会有很多重复序列，组装到一起是个难问题，而且如果要换位点，几乎整个构建重新来一遍，一个构建快的话要5-7天吧。为了减少off target还要同时用两个targets。ZNF与TALEN类似，但是一个模块识别三个特定的碱基，位点灵活性差，但是构建的ORF相对小得多，也存在重复序列问题。相反，CRISPR的Cas9和gRNA可以在一个质粒上（当然也可以分开），插入你的靶位点序列就可以了，一次构建2-3天搞定，而且随便轻松换位点。我们都不用连接，直接设计一对长引物线性化载体，消化模板质粒后，不回收，不连接，直接转化大肠杆菌就成了。最重要的是效率真的是高啊！用了再也不想停，哈哈，爱不释手。这个将来肯定诺奖，看能不能创造最快诺奖的记录，之前好像是iPS是最快的。