请教下大神，实时定量PCR（qpcr）实验，看扩增曲线的意义是什么？

病理医师

请教下大神，实时定量PCR（qpcr）实验，看扩增曲线的意义是什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/42886901

同花顺

实时定量PCR也被称为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)，是一种在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号积累实时监测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样品中的目的序列进行定量分析的方法。

基本原理
在学习实时定量PCR数据处理之前，我们首先需要了解一下它的数学原理，Ct值为什么是我们数据处理过程中的一个关键的因素。这两个图显示的是实时定量PCR的一组结果。上图是原始的线性图谱，下图则是处理过的指数图谱，但是它们两者表示的是同样的意思。x-轴表示PCR 循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，也就是扩增产物的量。这个图中有基线、阈值、Ct值这几个概念，从这几个值我们能够最终得到模板中目的基因的含量。




（1）那么什么是基线？如红色框所指，基线就是扩增曲线中的水平部分。在反应最初阶段，虽然产物是指数级增长，但是由于总量太少，其荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。因此基线信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。然而当累积了足够的扩增产物，足以产生可检测的荧光信号时，这个信号的值就被称为阈值，如红色箭头所指。通常阈值默认为基线信号的标准偏差×10。在阈值的前后，PCR的反应仍然是指数级增长的，因此此时的PCR结果可靠，可以准确地反映体系中模板的初始量。Ct值是信号强度达到阈值时所需要的循环数，也就是扩增曲线与阈值的交叉点，如图中的红点所指。

（2）我们可以看到图的右边显示了扩增曲线的4个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长的，但是在基线期我们没有办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的Ct值就成为了计算模板含量的一个关键值。




（3）那么，为什么知道了Ct值就能够得到最初的目的基因含量呢？图中表示一个基因的单次反应扩增曲线。上面这个公式计算的是扩增产物的分子数N，它等于模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是显然，在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此上述PCR理论方程只在指数期成立，也就是绿色框的部分。

数据处理
1、这里的三张图片分别展示了我们在做荧光定量PCR时提到的三个名称：扩增曲线，标准曲线，熔解曲线。



（1）扩增曲线：扩增曲线有两种展现形式，一种是线性，一种是对数形式。我们通常是用CT 来推算样品中样品的浓度。CT 值越高说明模板浓度越低。上面也详细说明了原理，在这里就不过多赘述。

（2）标准曲线：将已知浓度的样品（标准品）经过梯度稀释后分别取样进行荧光定量PCR，得到的一系列的Ct值，用这个Ct值与Log模板数对应可以得到一个相关的曲线，我们叫标准曲线。可以用这个标准曲线中的一些参数来判断这个荧光定量PCR体系的优劣。

（3）熔解曲线：Tm值，Melting Temperature（解链温度），PCR双链产物的退火温度。这两个图是在荧光定量PCR结束后，对产物进行逐步升温时进行的监测，可以看到在达到其解链温度时，荧光信号会有一个忽然的下降。我们将测得的这个曲线叫做熔解曲线。理论上如果PCR得到特异性产物则只有一个Tm值，在溶解曲线上表示只有单峰存在。如果是多相峰，那么可以判断产物不是单一的，发生了非特异扩增。




2、绝对定量：用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。绝对定量需要已知浓度的模板来建立标准曲线。绝对定量在我们的实验中不常用，所以只简单介绍一下。是通过样品的CT 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。




3、相对定量：是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异，也就是倍数差异。




以上图为例，分析结果是在试验组和对照组中某一个靶基因的相对比率，即倍数差异。
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进行相对定量可以以质量单位或者是参照基因作为标准，但是以参照基因作为标准的做法更加普遍，也更加方便，因此只介绍后者。用参照基因的优点是，这个方法能准确量化模板中的靶基因含量，尤其是当模板难以获得时，进行相对基因表达分析实验十分方便。但前提是我们必须要找到在不同状态中恒定表达的基因，而且它的表达水平不受样品处理方式的影响，比如热刺激，菌诱导等。

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MIQE指南是关于qPCR实验发表文章时所必需的实验信息提出的最低限度的标准。目的是让作者能够设计和报告更有价值的qPCR实验，使评阅人员和编辑按照相应的标准来评价所提交的文稿的技术质量，使读者更容易重复按照该指南发表的实验研究。本文小编将为大家详细介绍如何应用MIQE指南来指导RT-qPCR中的定量策略。

1、前言

当准备进行qPCR实验时，首先需要确定实验该如何设计，要做绝对定量还是相对定量呢？绝对定量要怎么做？相对定量又是怎么做？本文将重点介绍量化策略类型的优缺点，从而深入了解其局限性以及RT-qPCR效率如何影响量化结果。
2、定量策略

绝对定量使用标准 (或校准) 曲线将PCR数据与输入拷贝数相关联。因此，该校准曲线用于确定未知分析物的浓度。尽管传统上称为 “绝对定量”，但最好将这种方法称为 “校准定量”。这是因为，在这种情况下，“绝对” 一词具有误导性，因为现场样品的浓度实际上是与校准曲线中使用的标准样品的浓度 “相对” 测量的。此外，数据的可靠性还依赖于RT-qPCR中待测靶标和标准曲线的 “相同” 的扩增效率。

相对定量不需要校准曲线。由于这个原因，乍看比绝对定量更容易执行。相对定量用于测量mRNA表达相对于所选对照样品的变化，它主要基于靶基因相对于一个或多个内源性表达参考基因（管家基因）的表达。相对定量方法对于大多数实验目的是足够的，例如研究mRNA或microRNA基因在不同生理条件下的表达变化。用于表示相对量的单位通常为 “x倍变化”，并且可以在多个实验中比较相对量。




3、绝对定量

绝对定量需要用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量，将标准品稀释成不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Cq值为纵坐标绘制标准曲线：Cq= -klgX0+b。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Cq值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。




从上图可以发现，当模板起始浓度越大时，荧光达到阈值的循环数越少，即Cq值越小。反之，模板起始浓度越小时，Cq值越大。

为了保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。以基因组DNA为模板时就要选择基因组DNA作为标准品；进行mRNA表达解析时最好选择表达目的基因的Total RNA(或以Total RNA为模板合成的cDNA)作为标准品。即使扩增碱基序列相同，但整体模板不同，也有可能导致PCR扩增效率不同（比如基因组DNA和质粒DNA等）。

建立标准曲线，需要已知拷贝数浓度的标准品，对标准品进行5个以上的连续梯度稀释，将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增。最后根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程：Cq=-klgX0+b，其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Cq值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。
4、相对定量

相对定量是用于测定两个或多个不同样品中靶基因量的差异，得到的数据是目的基因在各样本中含量的相对比例。即将实验样本中靶基因的Cq值与对照样本的Cq值进行比较，结果用实验样本中靶基因量与对照样本中靶基因量的比值或差异倍数来表示。该方法在qPCR定量检测mRNA水平中最常见，研究生理变化对基因表达水平的影响。比如研究不同药物处理对Actin基因表达量的影响，就可以使用相对定量方法来研究。

相对定量需要确保实验样本与对照样本的靶基因从等量原料中得到。Cq值与起始样品模板量的浓度相关，但是两组样品间浓度能否调至完全相同呢？这就要求样品细胞起始数、RNA 提取效率、逆转录以及定量效率及操作必须完全一致，不存在操作误差等，这显然是无法达到的。最常用的是引入内参基因对样本的差异进行归一化。
5、内参基因选择

选择合适的单个参考基因或选择合适的参考基因组对于准确的RT-qPCR基因表达分析是极为关键的，并且是MIQE指南的必需报告内容。理想的内参基因应该具备以下几个条件：
① 不存在假基因 (pseudogene) ，以避免基因组DNA的扩增；
② 高度或中度表达 ，排除太高或低表达；
③ 稳定表达于不同类型的细胞和组织 (如正常细胞和癌细胞 )，而且其表达量是近似的，无显著性差别；
④ 表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；
⑤ 其稳定的表达水平与目标基因相似；
⑥ 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

针对在不同条件下表达差异的基因、呈现细胞周期性依赖表达的基因以及定位于X染色体的基因，都不是作为内参基因的首要选择。
6、RT-qPCR数据的归一化

相对定量时采用内参基因进行归一化，然后使用将归一化的数值进行比较得出差异倍数。对照样本的归一化后靶基因表达量被设置为“1”，实验样本的归一化后靶基因表达量以对比对照样本增加或降低x倍来表示。

相对定量的数据计算方法通常有2种：相对标准曲线法和比较Cq值法。标准曲线法中，先用标准曲线确定实验样本和对照样本中靶基因和内参基因的量，再用内参基因归一化两个样本中靶基因量。相对定量中的标准品的浓度无需已知。由于标准曲线法需要每一个待测基同内参基因一起单独做标准曲线，工作量大，成本高，只适合仅分析1个或几个基因的低通量实验。因此日常实验中常用的方法是比较Cq值法，即2-△△Cq法，计算方法如下：

步骤1：内参基因均一化样本差异
目的基因平均Cq值-内参基因平均Cq值=ΔCq

步骤2：处理和对照样本比较
ΔCq处理样本-ΔCq对照样本=ΔΔCq

步骤3：使用公示计算
倍数变化=2-△△Cq此公式用于计算所有待测样本与对照样本之间目的基因表达量的倍数变化，若F值=A（A＞1），则代表待测样本相对于对照样本表达量上调A倍；反之若F值=B（1＞B＞0），则代表待测样本相对于对照样本表达量下调1/B倍。

值得注意的是，2-△△Cq法需保证目的基因和内参基因的扩增效率基本一致才可使用。同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似；或制作标准曲线计算每一对引物的扩增效率。
7、RT-qPCR扩增效率

PCR的效率取决于许多因素，既存在抑制剂也存在增强剂，如下图所示。在所有比较样品中稳定和恒定的扩增效率是样品之间实现可靠比较的一个重要标准。




一种有效的用来确定 qPCR 实验是否是最优化的方法：将模板稀释成一系列浓度梯度进行 PCR 反应，用这个结果作标准曲线，模板可以用已知浓度的样品(如纳克级的基因组DNA 或多个拷贝的质粒DNA)或未知浓度的样品(如cDNA )。用模板初始量(或未知量样品的稀释倍数 )的log值对每个稀释样品的Cq值作图，两者呈递减的线性关系，称之为标准曲线。至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度，绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b。




理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式2n=稀释倍数决定，这里n是阈值线上扩增曲线之间的循环数(Cq值) 的差异。例如，10倍稀释的DNA样品，2n = 10，因此，n =3.32，即k=3.32，制作完标准曲线后，需要对其进行评估，评估指标有两个，相关系数R2和扩增效率（E）。相关系数R2反应了数据的线性关系，主要用来评估重复样品的可重复性和不同浓度的初始模板是否具有相同的扩增效率。R2值应大于0.98，该值越接近1，表示线性关系越好，数据越准确。

扩增效率（E）计算公式：E=10-1/斜率-1。一般认为扩增效率应介于90~110%之间，与之相对应的斜率介于-3.58~-3.1之间。
8、使用效率校正计算基因表达倍数

由于PCR效率在基因、测定、样品、试剂和仪器之间变化，引入实时PCR效率（E）校正有助于提供更准确的相对定量。然后将相对倍数变化定义为：




在这种情况下，计算步骤如下：
1.计算对照样品（control）和待测样品（treatment）之间目的基因（GOI）的Cq差异。

2. 计算对照样品（control）和待测样品（treatment）内参基因（REF）的Cq差异。

3. 确定每个基因（GOI和REF）的PCR扩增效率。

4. 相对表达比（R）代表与未处理对照组相比，一个GOI经历处理后的“x倍变化”，用REF的稳定表达进行归一化，计算中采用REF或GOI基因的最佳PCR效率E。
9、总结

用于可靠的mRNA或microRNA定量策略必须根据需要解决的生物学问题去设计。为了做到真实、可信和符合MIQE指南要求，所应用的定量策略必须经过高度优化和验证。近年来，科学家已经开发出许多软件工具使定量过程标准化并使结果可再现。这些工具及MIQE指南应用最终目的是降低运行、检测和所用SOP之间的实验室内变异性。此外，也有利于实时RT-PCR平台、分析软件工具之间以及全球不同实验室之间的结果的标准化和可比性。

根据实验目的的不相同，相对定量和绝对定量各有其不同的应用场景。绝对定量更多的应用于：病原体检测、转基因食品检测、基因表达研究。相对定量则更多的应用于：基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核、耐药性研究等。

同花顺

一．样品制备
1．PCR 扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行 PCR 扩增。扩增产物用 2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量 3-5ul。PCR 产物为 10ng/nl 左右为最佳。
2．PCR 产物与变性 buffer 混合。在干净的 PCR 管底部加入 5ul SSCP 上样缓冲液（变性缓 冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入 PCR 扩增产物。按照经验，扩 增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加 1ul，效果很好加 0.5ul，如果不太好就适当增加 1.5、2 或 3 不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加 3ul 的 PCR 产物，缓冲液加到 8ul 变性效 果更好。
3．PCR 产物变性。加好的样品进行离心，使样品集中在管底。PCR 仪上 95℃变性 10 分钟， 立即取出 PCR 产物连同架子一同置于冰上静置 5min，以免变性的产物复性。
注：3 和 4 步可以在制 SSCP 胶第四步后，等胶凝的过程中进行。
二．制胶
1． 装板。在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用 ddH2O 冲洗，然后使用 吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待 2-3min 酒精挥发。将玻璃板组 装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。（可用无水 乙醇测试是否漏胶）。
2． 配胶。
甘油浓度 50%的几种浓度大板胶（10ml 下层胶，5ml  浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：

	8%	6%
30%PAGE	2.7ml	1ml
10×TBE	1ml	0.5ml
50%甘油	1ml	0.5ml
ddH2O	5ml	3ml

APS	70ul	70ul
TEMED	12ul	8ul
Total	10ml	5ml

甘油浓度 50%的几种浓度小板胶（15ml 下层胶，10ml  浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）

	8%	6%
30%PAGE（4℃）	4.05ml	2 ml
10×TBE	1.5ml	1m
50%甘油	1.5m	1m
ddH2O	7.5ml	6ml
APS	105ul	70 ul
TEMED	12ul	12ul
Total	15ml	10ml

3．灌胶。配好胶后搅匀，灌入装好的玻璃板中，注意不能产生气泡，如果产生气泡把板立起，轻轻敲打可使气泡升出胶面，胶面与凹板上沿大约差 0.5cm 时插上梳子，要保证梳子齿和液面接 触处没有气泡，一旦产生要拔出重插。
4．静置。灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度（10o 以下）静置水平桌面上 30min 左右使 之充分聚合。
注：此时可以进行 PCR 样品变性，即第一部分的 3、4 步。
二．上样

1.安板。PAGE 聚合好后要及时拔出梳子（时间耽搁长后会使梳子很难拔出），拔梳子时要用力均 匀以保持胶孔的整齐。用夹子把胶板固定在电泳槽上，凹槽的一面朝里，安板时首先使板的底边 一端先接触电泳液，再缓慢地过度到另一端，以免产生大气泡（产生大气泡会使电泳条带弯曲）。 2．预电泳。从底槽把一些电泳液 1×TBE 吸到上槽，使液面高出玻璃板矮边 1cm 以上，并确保 上槽不漏液。打开电源，大槽电压调到 140-150V，小槽 110-120V，预电泳 10min 左右。 (0.1W/cm,10℃，1-3h)
3．点样。用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。由于边缘效应带型不整齐，每块板中最边上的两个孔最好不要点样。
4．电泳。大槽电压 140-150V，小槽 110-120V，温度在 10-15℃，恒温电泳 10 个小时以上。
三．染色

1．固定。把胶卸下，做好起始记号，放入 70%乙醇中在摇床上固定 15min。固定好后乙醇回收（可以重复使用 5 次左右），蒸馏水洗两遍，每遍 3min 左右。若同时染两块胶固定和洗脱都要适 当增加时间。
2．染色。染色液（200ml 染色液含 3.6%的 NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水 2ml）染 色 30min，同时染两块胶要适当增加时间，需 40min 左右。倒掉染色液，洗 3 遍，每遍 3min， 同时染两块胶要适当增加时间。
3．显色。显色液（200ml 显色液包含 1%柠檬酸钠 1ml，甲醛 100ul）至清晰。倒掉显色液， 加蒸馏洗脱 3 次停显。
(也可将凝胶浸在含 0.5ug/ml 溴化锭的 1×TBE 缓冲液中染色 10min，在紫外灯下观察)
附录

1.  甘油浓度 50%的几种浓度大板胶（10ml 下层胶，5ml  浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：

	8%	6%
30%PAGE	2.7ml	1ml
10×TBE	1ml	0.5ml
50%甘油	1ml	0.5ml
ddH2O	5ml	3ml
APS	70ul	70ul
TEMED	12ul	8ul
Total	10ml	5ml

2. 甘油浓度 50%的几种浓度小板胶（15ml 下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶  1.5mm）

	8%	6%
30%PAGE	4.05ml	2 ml
10×TBE	1.5ml	1m
50%甘油	1.5m	1m
ddH2O	7.5ml	6ml
APS	105ul	70 ul
TEMED	12ul	12ul
Total	15ml	10ml

3．10×TBE 的配方：
108g Tris 碱、55g 硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容 1L
4.变性 buffer 的配方
98%去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青 FF、0.025%溴酚蓝
注意事项：

①重复性.影响 SSCP 重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变， SSCP 图谱可保持良好的重复性.一般 SSCP 图谱是二条单链 DNA 带，但有时有的 DNA 片段 可能只呈 现一条 SSDNA 带，或者三条以上，这主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的立体构象.有时 三条以上的 SSCP 图谱是由于野型 DNA 片段和突变型 DNA 片段共同存在的结果.
②靶 DNA 序列长度的影响在实验中发现 SSCP 对短链 DNA 或 RNA 的点突变检出率要比长 链的高，这可能是由于长链 DNA 和 RNA 分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小 的缘故.而有人认为在 DNA 链较短的(400bp 以下)情况下，DNA 的长度不会影响 SSCP 的效果.
③电泳电压和温度的影响:为了使单链 DNA 保持一定的稳定立体构象，SSCP 应在较低温 度 下进行(一般 4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原 因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行 SSCP 时，开始的 5min 应用较 高的电压(250V)，以 后用 100V 左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链 DNA 初步 分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使  之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.
④SSCP 的结果断定:由于在 SSCP 分析中非变性 PAG 电泳不是根据单链 DNA 分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分 离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此 一般要求电泳长度在 16--18cm 以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变 DNA 片段与 正常 DNA 片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该 DNA 序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为 3mm，那么当两带间距离 在 3mm 以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假 阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如 PCR 产物的上样量，PAG 的交联度、以及胶的浓度 等，都应根据具 体实验进行选择确定.



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清风寡欲

QPCR必备五，是这个QPCR实验流程中的第五期，这一期视频主要讲了QPCR的数据分析，告诉你什么样的数据是可用的，涉及扩增曲线，CT值，溶解曲线的意义分析，以及它的一个判断标准，希望对你有帮助，大家一起实验顺顺利利

感恩由您

扩增曲线可以粗略地判断扩增效率。SYBR Green的双delta Ct法要求目的基因和内参的扩增效率基本一致。如果不一致，需要对公式进行修正，部分qPCR仪的配套软件可以做到，直接输入每对引物的扩增效率。但无论如何，保证高扩增效率是实验成功的关键。如果扩增效率一致，不同Ct的曲线显示出来就基本是平行的位移，其倾斜程度基本一致。而如下图一样，一条比较“陡”，另一条比较“平”，那么意味着扩增效率不一致。有可能是引物效率不一，或者个别样品、反应孔存在抑制PCR的污染等。


                                                                                               来自肽度时界威客吴博士