聊一聊液体活检这件事儿

检验之星

题记：近来液体活检随着产前无创诊断被公众逐渐认知而愈演愈烈，国内外大小会议都多次将其作为会议主题进行讨论，在精准医疗这艘航空母舰开始起航之时，承载在其上的液体活检到底扮演怎么样的角色？本文着力回答这个问题。
到底什么是液体活检？
这个问题从两个方面来回答：1，医院检测有利于明确病理类型，辅助诊断。在医院医生经常会开一些化验单，最常见的就是三大常规“血常规、尿常规和大便常规”，这有助于辅助诊断。对于一些复杂的患者，医生可能会通过手术、穿刺的方式取得组织，然后送往病理科以明确疾病类型。2，液体活检其实是相对于组织活检来说的。组织活检指对患者获取少量病变组织或者细胞材料而进行显微镜病理形态学检查，多说几句，病理科专家需要受非常严格的训练，而且各病理专家的观察鉴别能力是有较大差异的，曾经了解的北京协和医院某病理科专家就具有非常好的专业技能，有实力已经非常强医院的病理科不能判断的样本找来向他请教，他看一样就能分辨出是什么类型。液体活检指通过体液的检测代替活检，目前主要包括：外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），血浆游离DNA（cfDNA）循环肿瘤DNA（ctDNA），外泌体；当然次要包括：唾液、尿液及其他体液（如胸水、腹水等）。

为什么推行液体活检，它有何独到优势呢？
这个问题从四个方面来讲：1，目前液体活检应用最广泛的是无创产前诊断Non-Invasive Prenatal Testing（NIPT）和肿瘤基因检测。2，无创产前NIPT对许多人其实并不陌生。每一个准父母如果事先知道自己的宝宝有遗传或者其他严重疾病，为了减轻家庭和宝宝痛苦都会尽可能选择适时终止妊娠。以前广泛采取的方法是有创产前诊断，即行羊膜穿刺术取羊水进行判断，这种方法有一定风险性。诺贝尔奖大热门的香港中文大学卢煜明在1997年第一次在孕妇外周血中发现了胎儿的游离DNA，如今基于此发现已经有成熟的检测技术。NIPT商业上主要用于检测染色体加倍（21-，18-，13-三体综合征）检测，其中21-三体综合征又称为唐氏综合征（1/700）、18-三体综合征又称为爱德华氏综合征（1/4000）、13-三体综合征又称为Patau综合征（1/25000）；NIPT只需要5-10ml血液即可进行检测，而且检出率达到100%，特异性达到97.9%-99.7%；这意味着准妈妈承受更少的痛苦（无创）、方便快捷、且保证了较高的准确性。3，肿瘤液体活检基因检测相对NIPT就要复杂得多。由于一个肿瘤病灶中的不同肿瘤细胞并不相同，采取手术或者穿刺获得的组织去病理检测或者测序，非常有可能只取到一部分样本而导致反映信息不全，这是由于肿瘤本身异质性的特点导致的；第二个原因是有的患者由于身体原因不适宜做手术，一些晚期患者甚至即使做手术或者穿刺也无法获取足够的样本量用以判断肿瘤特性；第三个原因，肿瘤发展是一个动态变化的过程，有时候需要动态监测进行多次取样检测；第四个原因，患者的组织样本或以切片形式存放于病理科，等到需要之时再分析，或者其他原因，而ctDNA半衰期仅为2小时，因此液态活检可实时反映肿瘤当前情况。4，肿瘤液体活检基因检测有无创、全面、实时、连续取样等优点，因此受到广泛关注。5-10ml血液，血液中的DNA含有肿瘤的相关信息。

液体活检检测的对象是什么，它们的来源是什么？
这个问题在前面有所提及，在这里会较为详细的说明。1，目前液体活检主要的对象其实是ctDNA, CTC和Exosome (外泌体)。2，外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）其实就是一系列肿瘤DNA片段，它有四个主要来源：循环肿瘤细胞、肿瘤细胞凋亡后游离至血液、肿瘤细胞坏死游离至血液、外泌体。ctDNA含量约占cfDNA的0.01%-1%，因此检测方法的灵敏度显得至关重要。整个血液中cfDNA片段的大小分布是，绝大多数为166bp，一部分为322bp和488bp，其它大小的cfDNA片段分布频率较低。这里我们做一个简单的计算：介于液体活检时一般抽取10ml外周血，而血清体积约占全血体积的40%，那么血清体积约为4ml，这4ml血清约有100ng基因组DNA（据实验室同事讲，一般2ml血浆可提取50-60ng cfDNA），疾病状态白细胞数量可能会非常多；值得注意的是：健康人血液中的cfDNA浓度小于肿瘤患者。3，循环肿瘤DNA （CTC）其实就是肿瘤病灶上的肿瘤细胞进入到血液里了。它的特点是携带了原发灶和转移灶的信息，血液中的浓度为1/10^6 ~ 10^9。其实如果能够保证捕获到CTC，那还是相当不错，因为它保留了整个肿瘤细胞的信息。4，外泌体是细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30-120nm的膜性囊泡，内含物大部分是蛋白质，同时含有大量的mRNA、miRNA、lncRNA和cirRNA，而肿瘤细胞产生的外泌体可检测到过度表达的蛋白标志物，外泌体含92897种蛋白质、584种脂类分子、4934种miRNAs及27642种mRNA。

循环肿瘤DNA (ctDNA) 检测为什么可以？
这个问题从五个方面讲：1，根据近来文献发表数量、国内外相关领域公司数量及国内会议讨论的热点，我们可以认为ctDNA的研究远热于CTC。2，肿瘤患者的血液里的情况是这样的：患者原发灶或者转移灶的肿瘤细胞释放长度约166bp的DNA片段，正常细胞也会做同样的事情，那么血浆里的cfDNA大部分都是来自于正常细胞的，随意捏造个数据以便理解：98% Normal 166bp，1% Normal 322/488/Other bp，0.9% Tumor 166bp，0.1% Tumor 322/488/Other bp。理论上讲，这些碎片DNA应该是覆盖整个基因组的。3，我们现在要做的事情是把这1%的ctDNA从cfDNA中挑选出来，可是怎么选呢？有的ctDNA片段不是和正常细胞脱落下来的DNA片段一模一样嘛，如果这部分没发生任何突变的。不错，这部分DNA片段我们是挑不出来的，想要达到以下效果是不可能的：所有来自于肿瘤的DNA片段集中起来形成一个基因组，所有来自于正常细胞的DNA片段集中起来形成一个基因组；那么我们怎么认为它是ctDNA呢？肿瘤细胞内DNA特定位置发生变化我们大多数情况是知道的，只需要做大样本对比研究就可以了。于是我们只需关注这个特定位置是否发生了我们预期的突变，如果发生了我们则认为它是来源于肿瘤细胞的DNA，即ctDNA，因为以前的研究表明正常细胞根本不会在这个位置发生突变。4，基于以上的说法，我们有两大类方法来进行ctDNA检测。第一是通过测序的方法，我把你这些DNA片段序列测出来，然后去翻字典对比，如果你是常见共识的肿瘤DNA典型突变，我就认为你这条DNA片段是ctDNA。第二是通过PCR的方法，即我认为基因组上某个特定位置的DNA会发生某个特定的突变，我根据这个特定设计一个引物，如果最后扩增出来我预期突变的DNA，那么我就认为这个DNA片段是源于肿瘤细胞的，即ctDNA。5，这里检测ctDNA面临一些问题：99%正常DNA VS 1% ctDNA （ctDNA含量有些情况下更低），当变成是99.99% VS 0.001%，测序或者PCR法真的能检测出来吗？这就涉及到技术灵敏度的极限值问题了；肿瘤细胞变异的类型也非常多，点突变、插入与缺失、融合等，每一种类型都能够准确无误的判别吗？这就要求分析团队非常专业。

循环肿瘤细胞CTC检测怎么样？
这个问题从以下几个方面讲：1，CTC来源于肿瘤的原发灶或转移灶，它能够代表肿瘤的全部信息，包括从基因组到蛋白功能等一些列信息。CTC还可以培养，用于筛选药物。CTC不仅仅是一个标志物，同时也可能是药物的靶点。2，CTC一般数量很少，10ml血中只有1-10个CTC，却有500亿个红细胞和上亿个白细胞。3，应该说CTC非常有前景，但是目前应用几乎仅限于CTC的数目作为标志物。4，运用什么技术可以从上亿个细胞中分离出几个CTC呢？这里得首先说一下CTC的特征，肿瘤细胞表面表达EpCAM抗原，CTCs与大部分血细胞存在明显的尺寸差别。第一种方法：以CTCs表面抗原和免疫荧光为基础的方法，利用偶联了EpCAM （上皮细胞粘附因子）抗体的磁颗粒与肿瘤细胞表面的抗原相结合，然后结合荧光染料的抗-CD45和抗细胞角蛋白(CK8/18/19)，最后采用DAPI染色来鉴定细胞核，EpCAM（+）CK（+）DAPI（+）CD45（-）的细胞被界定为CTC并进行计数，然而事实上，各种不同组织来源的肿瘤细胞只有70％表达EpCAM，一些肿瘤细胞由于发生了上皮间质转化（EMT) ，上皮细胞特异性抗原丢失使得单一抗体捕获CTCs的效率降低；第二种方法：基于CTCs与大部分血细胞存在明显的尺寸差别以及CTCs较正常血细胞不容易变形。研究表明运用8微米的虑孔分离CTCs效果最佳。富集到的CTCs可再通过光学染色或免疫染色(免疫荧光或免疫细胞化学)从形态学特征或分子特征等方面来确认肿瘤细胞，只是这种方法可能会漏检某些直径较小的CTCs。5，当我们分离了CTCs，再进行计数、测序等别的应用。

从事液体活检都有哪些靠谱的公司？
Foundation Medicine
Grail：Illumina与Memorial Sloan Kettering合作成立
Guardant Health
Roche：收购CAPP Medical
Color Genomics
Trovagene

外泌体研究得怎么样了？
说实话，这方面接触确实不多。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/22838402