RT-PCR完全攻略

幸福侠侣

RT-PCR是分子生物学中一项常规的实验，但对于刚刚进入实验室的小伙伴来说可能比较陌生。今天，我们就来聊聊如何进行RT-PCR操作。
准备阶段：合成引物，购买RNA提取试剂盒，购买反转录试剂盒，购买RT-PCR试剂盒，购买耗材：八联管，无酶加样枪头，无酶手套。
在进行RT-PCR之前，我们需要设计拟分析基因的引物，如何设计呢？首先我们需要找到该基因的编码序列CDS(Coding sequence)。这里我们以血红素加氧酶HO-1基因为例，在PubMed中的Gene数据库中进行查找。



点击Search, 进入下级界面，找到正确种属，这里以human为例



点击HMOX1，进入下级界面，往下翻



点击红色方框内链接，进入下级界面，往下翻，找到CDS



点击CDS,进入下级界面



点击右下角的FASTA,就能得到我们需要的序列



方框中的序列即为HO-1的编码序列。有了编码序列接下来可以设计引物了，网上很多网站可以进行这一工作，这里我们偷下懒，用上海生工的免费引物设计功能



当引物设计好后，就可以开始正式实验了。注意除了目的基因的引物，还需要内参基因引物，例如β-Actin,GAPDH。

提取RNA：提取RNA,常用的如trizol法，吸附柱法。当然，这些都有相应的试剂盒，这里不做推荐。根据经费情况选择适宜的国产或进口试剂盒，按照说明进行操作就可以了。

RNA纯度检测:当用试剂盒提取到RNA后，需要对RNA的纯度进行检测，一般用微量分光光度计测定OD260/OD280的比值，介于1.9-2.0（或1.8-2.0）说明RNA纯度较高。

RNA完整性检测：通过RNA电泳，检测28S,18S,5S等小分子RNA条带，具体操作步骤根据购买的试剂盒说明书进行。

逆转录：这一步的目的是将RNA逆转录成cDNA,购买相应的反转录试剂盒，按照说明书进行操作即可。注意，该操作在八联管中进行，会用到qpcr仪（根据实验室qpcr仪操作说明完成操作）

qPCR:得到cDNA后，可以对其进行扩增并检测，SYBR染料法和探针法比较常用，根据需求选择相应的试剂盒。将相关试剂加入八联管(一般来说每个样本设置3个或4个复孔。记得要加入内参基因!)，放入qpcr仪中,设置好温控程序，该程序可以使用qpcr试剂盒说明书推荐的程序，也可以按照实验室以往设置好的程序。

等待一两个小时后，就可以导出我们所需的Ct值进行分析了。但现在很多qpcr的程序中只能导出Cq值，两者是可以互通的。

数据分析：假设我们得到下面一组数据（瞎编的数据,Well编号出现了重复，之前没有注意，大家无需理会）



对数据进行分析：我们可以获得基因的绝对表达情况，需要作标准曲线，这也不难。但用得更多的是评估每个基因的相对表达。一般采用2-ΔΔCt计算，这里简单演示一下。
利用公式计算复孔平均值



ΔCq=每组内基因的Cq-内参基因的Cq



如法炮制，得到所有的ΔCq



ΔΔCq=实验组基因的ΔCq-对照组Control对应基因的ΔCq，如图所示



有了ΔΔCq，接下来就可以计算2-ΔΔCt

选择公式，输入power,点击转到



进入power函数设置窗口



Number输入底数，Power输入幂值-ΔΔCq



重复三次试验，就可以获得三次数据，有了三次数据，就可以进行统计分析了（有的数据处理是进行三次独立实验，有的会有其他操作，这里仅对方法介绍）。

统计分析：打开graphpad



输入三次实验的数据，这里没有实验数据，就随便填写了几个



输入数据后，点击Analyze,对实验数据进行统计学分析，选择适合自己实验的统计学方法



另外，点击Graphs可以绘制图片



至此，RT-PCR实验流程基本走完。

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