分子诊断在兽医体外诊断的趋势

临床医师

作为一种在兽医诊断领域新兴的检测技术，PCR因其无可比拟的优势受到了越来越多的关注，也将会引领兽医体外诊断技术发展的潮流。本文系统性的阐述了分子诊断的优势以及目前困扰兽医师们常见的问题。相信通过本文的阐述，可以让兽医师们从一个专业、客观的角度重新认识PCR及其相关技术。
体外诊断对于医疗决策至关重要，据统计，目前全球超过65%的医疗决策是基于诊断信息所作出的。
体外诊断是指在生物体之外，通过对生物体样本（血液、体液、组织等）进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。体外诊断产品主要由诊断设备（仪器）和诊断试剂构成。随着现代科学技术的进步，体外诊断技术得到了迅猛发展。



以PCR为代表的分子诊断引领着体外诊断技术发展的第四次革命
纵观体外诊断技术的发展经历了四次革命。化学技术的发展（如血液的常规生化检测）为体外诊断技术带来第一次革命性的进步，从此，实验室检查不仅仅是单纯的形态学观察和描述。
体外诊断技术的第二次革命源于人类对“酶”的认识和酶学技术的发展。如临床上血清和尿液的淀粉酶、血清乳酸脱氢酶和天门冬氨酸转氨酶的临床检测等。
免疫学的发展和免疫技术的应用为体外诊断技术带来了第三次革命。这种采用抗原-抗体结合原理建立的各种检测方法在临床上广泛应用，不仅用于检测各种肿瘤标记物、自身抗体，还可以用于检测感染性疾病标志物和激素等。
分子诊断技术的迅猛发展无疑是体外诊断技术第四次革命，分子诊断主要是应用分子生物学方法检测生物体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的诊断技术，可以从基因层次进行检测。
目前，分子诊断技术以其具有的灵敏度高、特异性强、简便快速、可进行定性、定量检测等优势，已广泛应用于感染性疾病（包括细菌性感染、病毒性感染、寄生虫、真菌、人畜共患疾病等）、肿瘤等多个领域。分子诊断的检测结果对临床医疗决策的贡献度进一步提升，检验结果的重要性也达到空前的高度。
以PCR为代表技术的是当前分子诊断最常用的简称方法。PCR技术是用一对寡聚DNA作为引物，通过变性-退火-延伸这一周期多次循环，使目的DNA得到扩增，具有高灵敏性和高特异性的优势。实时荧光定量PCR实现了PCR从定性到定量的质的飞跃
实时荧光定量PCR技术（将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助荧光信号，累积实时监测整个PCR的进程）不仅具有传统PCR的优势，还具有特异性强、灵敏度高、重复性好、反应速度快、定量准确和自动化程度高等特点，成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。



实时荧光定量PCR可以早期、精准的诊断宠物疾病
在目前的宠物临床工作中，广泛存在着对一部分病原诊断困难或者不能精确诊断的问题。具体表现在以下几个方面：
1. 现有的诊断技术灵敏度低，如：常见用于病毒诊断的胶体金试纸。虽然，胶体金试纸可以提供快速诊断，但是该种方法是从蛋白水平对病原进行检测，存在一定的交叉反应和动物自身抗体干扰，导致临床应用的过程中出现假阳性和假阴性的结果。
2. 疾病的早期诊断（如潜伏期）和抗原要求较高的疾病，使用传统的诊断技术（胶体金试纸和ELISA检测方法）无法提供准确的诊断依据。如临床上常见犬瘟热和细小病毒；
3. 临床上有很多的病原没有商品化的便捷的试剂商业化生产，这一部分的病原诊断（如猫传染性腹膜炎）目前在兽医临床工作中还不能做到在医院内诊断。如果需要做血涂片、粪检的疾病，导致主观性较强，易产生漏检的现象。
4. 在疫病防治过程中，如注射疫苗是预防犬猫病毒性疾病的主要措施，但是血清学检测出的抗体很难区别是疫苗免疫还是病毒感染产生的，而PCR能够精准的检测病原体。
5. 临床上还有一些病原在微量时存在诊断困难的情况，比如巴贝斯虫等疾病。因此PCR（尤其是实时荧光定量PCR）使这些疾病的精准诊断成为现实。
因此，农业部《2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》的要求，以及我国现行的宠物疾病诊断国家标准中颁布了《犬细小病毒诊断技术（GB/T27533-2011）》和《犬瘟热诊断技术（GB/T27532-2011）》国家技术标准，明确将犬细小病毒和犬瘟热病毒核酸检测（而非试纸卡检测）作为诊断标准，这也说明核酸检测在动物疫病诊断中的重要地位。



选择一款合适的PCR对于宠物的诊断尤为重要
在临床工作中，目前有很多PCR供兽医师们选择，有核酸免提取的、有等温扩增的、有液体试剂和冻干试剂的，让兽医师们无从选择，到底应该怎样客观的看待这些，做到科学的选择呢，接下来会详细的阐述。
核酸免提取会导致假阴性的概率增加
核酸提取是分子诊断实验的“第一步”，是十分重要的环节，因为首先必须把宠物样品中的核酸提取出来，才能进行后续的检测，可见核酸提取的重要性。核酸提取具有两大目的：提纯（消除样本中干扰物质）和浓缩（提高样本中核酸浓度）。因为，对于PCR所检测样品（血清、全血、细胞保存液和粪便等）中有很多干扰物和抑制物，核酸含量低，直接检测核酸难度高，灵敏度差。因此检测之前，需要将样品中的核酸裂解，提纯并浓缩，也就是核酸提取。这是业界的主流做法。
比如临床上一些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脱液，成分很简单，几乎是生理盐水+少量分泌物+大量游离的病毒，可以不进行核酸提取直接扩增。猫的疱疹病毒FHV-1用拭子在口鼻采样就能检出。如果拭子的洗脱液比较干净，可以省去提纯这一步，但是不经过浓缩，降低了检测的灵敏度。
此外，复杂样本必须要进行核酸提取。比如猫的冠状病毒（FCoV）大多检测的是猫的腹水，腹水样本非常粘稠，里面蛋白很多，无法直接检测。这种样本免提取直接扩增就不是灵敏度下降的问题了，而是无法检测出来的问题。
等温扩增成为发展新趋势
等温扩增仪器简单，检测时间快，检测灵敏度与PCR相仿。但等温扩增技术多为外国发明，现在还都在专利保护期内，但在苏州，有一家先达基因，其拥有完全独立自主知识产权的酶促重组等温扩增技术（ERA技术），通过基因工程对重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行改造，建立特殊扩增反应体系，在30-42℃恒温条件下，20分钟内，可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增109倍，从而达到可检出水平。该技术具备PCR扩增的特异性和恒温扩增LAMP技术的便捷性，准确度极高。
真空冻干技术具有诸多优点，是PCR试剂的趋势
PCR的试剂成分包括纯化水、引物、聚合酶、Mg2+、dNTP和探针等成分。这些成分混合后，常温下会逐渐降解失效。所以液体PCR试剂需要分装到不同的小瓶-20℃保存，用时再解冻配制。因此，试剂的储运和操作都比较麻烦。
而真空冻干技术可将试剂内部的水分完全升华掉，同时不破坏有效成分。冻干之后的试剂可以常温保存，无需冷链运输。使用时加入水就能溶解，然后像正常的PCR试剂使用，因此是PCR试剂的趋势。
分子诊断作为体外诊断技术的第四次革命，应用分子生物学方法，检测患者（宠物）体内遗传物质结构或表达水平的变化，继而作出诊断的技术，它为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供了更为准确的信息。较其他检测方法相比具有不可比拟的优势。而PCR作为分子诊断最常用的检测方法，在宠物的临床诊断中也越来越重要。

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