PCR实验中的内参基因：不只是对照那么简单

莺歌燕舞

在分子生物学研究中，PCR技术是检测和定量基因表达的重要手段。而内参基因，作为PCR实验中的一个关键因素，其作用远不止是对照那么简单。本文将详细探讨内参基因在PCR实验中的多重作用。


内参基因的三大作用

1. 样品提取质量的判断标准
在PCR实验中，内参基因首先作为判断样品提取是否成功的标准。当使用逆转录得到的cDNA进行PCR实验时，如果结果为阴性，不能直接得出样品中没有目的基因的结论。只有当内参基因的CT值处于一个合理的范围内，例如20左右，我们才能确信样品制备没有问题，从而确保实验结果的可靠性。
2. 目的基因表达量的计算基础
在进行相对定量PCR时，内参基因是计算目的基因表达量的基础。由于每个样品的提取效率可能存在差异，直接比较不同样品的CT值是没有意义的。只有将目的基因的表达量与内参基因的表达量进行校正后，得到的比值才具有可比性。这个比值可以量化，最终转化为表达量的RQ值，为基因表达的定量分析提供了准确依据。
3. 熔解曲线分析的重要参考
内参基因的CT值也是分析熔解曲线的重要参考。当qPCR的熔解曲线出现非单峰现象时，除了考虑引物设计的问题外，还应检查内参基因的CT值。如果内参基因的CT值过高，如超过30，同时目的基因的CT值也很大，接近40，这可能意味着模板浓度过低，增加了非特异性扩增的风险，导致目的片段含量不足。这时，需要重新制备PCR模板以确保实验的准确性。
内参基因在PCR实验中扮演着至关重要的角色。它不仅是判断样品提取质量的标准，也是计算目的基因表达量的基础，并且在分析熔解曲线时提供了重要参考。正确理解和运用内参基因，将大大提高PCR实验的准确性和可靠性，为分子生物学研究提供坚实的数据支持。


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