一文搞定恒温扩增分子诊断（RPA/ERA）

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分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。恒温扩增方法有多种，今天就回顾RPA/ERA，让大家一文通俗搞定~~
为了确保大家所认知的基本概念是一致的，请先了解以下名词解释

• 重组酶聚合酶扩增技术，RPA, recombinase polymerase amplification
  
• 酶促重组等温扩增技术，ERA, Enzymatic Recombinase Amplification
  
• 重组酶，recombinase，同引物形成蛋白-核酸复合物，指导引物与模板结合，起到定位作用；帮助DNA 模板的解链和促使模板与引物之间发生链替换。
  
• 单链DNA结合蛋白，SSB, single stranded DNA binding。同置换出来的单链DNA结合，防止DAN配对两条链再次结合。
  
• DNA聚合酶，DNA polymerase，以DNA为模板，利用dNTP合成子代DNA。
  
• 核酸内切酶，endonuclease，可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸。
  
• Nfo，来源于细菌的核酸内切酶，且更倾向于作用于3′凹末端的双链DNA，参与DNA损伤修复。
  

RPA和ERA的工作原理
相同点：

• 3种关键酶或蛋白：重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶；
  
• 在37℃恒温下进行核酸快速扩增；
  

不同点：酶的来源不同，主要是因为专利原因。

• RPA的重组酶来源于T4噬菌体；
  
• ERA的重组酶来源于细菌，病毒和噬菌体。
  

下面以RPA操作原理为主进行系统的应用介绍
RPA工作原理要点：
1、在ATP存在条件下，重组酶与引物结合, 形成蛋白-核酸聚合体，并搜索配对目标；
2、当引物寻找到配对DNA模板，ATP水解供应能量，重组酶离开引物，并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA链；
3、同时，单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNA binding, SSB)同被置换出来的DNA单链进行结合，防止DNA模板再次形成双链。



RPA原理图

基于RPA方法的探针检测法
工作原理要点：
1、在RPA系统中，添加特异性探针；
2、探针中引入四氢呋喃修饰位点，四氢呋喃修饰核苷酸在DNA聚合酶作用下，可以几乎100%效率实现DNA链延伸；
3、在四氢呋喃修饰位点的临近处偶链发光基团和淬灭基团；
4、当探针同靶序列结构形成双链DNA，Nfo在巡视过程中遇到四氢呋喃修饰位点则认为DNA出现损伤需要进行修复，故对探针上的该位点进行剪切，从而释放荧光基团；
5、剪切后的探针，具有游离3‘-OH，所以可以作为引物继续合成新模板；
6、使用不同的荧光探针，可以实现多重PCR检测。
ERA方法的探针检测法



荧光型核酸扩增试剂盒（ERA法）探针设计示意图



ERA荧光型原理图

介于RPA方法胶体金层析检测法
工作原理要点：
1、同样在RPA系统中，引物5‘端标记生物素；
2、添加探针，探针同样带有四氢呋喃修饰位点，5’端带有荧光基团FAM，3‘端进行修饰，使得无法延伸；
3、当探针同由5‘端带有生物素标记的引物扩增的靶DNA产物配对时，Nfo切割探针，形成游离3‘-OH，可以作为引物继续延伸，合成子代靶DNA序列；那么子代靶DNA序列就会同时带有FAM荧光基团和生物素。
4、胶体金颗粒上标记抗FAM荧光基团的抗体；
5、NC膜上包被 C线为抗FAM的抗抗体；T线为抗生物素抗体，这样就会在T线去形成抗生物素抗体/生物素-目标靶系列-FAM/抗FAM抗体-胶体金的阳性复合物。
ERA方法胶体金层析检测法



试纸条型核酸扩增试剂盒（ERA法）探针设计示意图



小结

• RPA/ERA整个反应非常速度，约30min就可以得到结果；
  
• 灵敏度可达10copies/ul；
  
• 扩增引物长度30-35bp，太短引物会影响特异性、灵敏度和扩增速度；
  
• 且扩增期间不需要复杂的仪器；
  
• 在此基础上开发的探针法或胶体金层析法都大大简化了检测结果的使用仪器，可以更好的满足不具备分子检测条件的基层或者经济较为落后的地区。
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/369063630