分子诊断，路在何方？

病理医师

血液病的诊断与治疗，与分子检测密切相关，无论是在疾病的诊断、预后评估还是疗效监测，分子检测都已经发挥了无可替代的作用。

我们现在的诊疗模式，就是病人来到医院，通过各种辅助检查，包括实验室的、病理的、影像的，分子的检测，相应的结果拿过来以后，去医生那里进行汇总、诊断、治疗。

而对于血液病的实验室医生来说，我们是不幸的，又是幸运的。不幸的是我们没有兄弟科室的帮助，没有病理、影像的辅助诊断，需要我们自己单打独斗；而幸运的是，这份责任给了我们实验室人巨大的责任感和勇气，鼓舞和推动着我们不断探索和进步。






血液病的分子检测，最开始是普通PCR，通过跑胶对单个基因进行检测，后来有了荧光定量PCR、FISH，二代测序这些，整个的发展流程是从我们已知的、单个基因的检测，到未知的、多个的、更广泛的基因检测，这是我们技术上的进步。

从测序的发展史可以看到，技术的发展其实是越来越快的，一代测序到二代测序之间隔了十几年，二代到三代之间隔了几年，我们可以大胆的推测，新的技术手段可能在不久的将来就会应用到实验室和临床，这是我们所需要面对和思考的。






大家可以看看，这是前两年实体肿瘤比较火的伞式研究和篮式研究，现在的治疗模式，正在尝试从以往病理诊断过渡到基因诊断。我们不再说食管癌，肺癌什么的，我们要根据找到的基因Marker，去找到靶向药进行治疗，这是我们对整个疾病诊疗模式的一个革命。






在血液病上也是一样，近年来也已经出现了针对AML、MDS的伞式研究和篮式研究，探索根据检测到的很多标志性的基因突变，去决定它后续采取的治疗方式。

二代测序这两年很火，这个技术把分子诊断的水平提升了一大步，它给我们带来了海量的数据，但是这些数据如何应用到临床，其实是给我们提了一个很大的问题，所以今天我们需要思考，分子诊断走到这一步，下一步我们该怎么走？下面是我们的一些想法。






现在很明显，就是能检测的基因越来越多，从2006年的时候，NCCN推荐做FLT3基因突变检测（没有要求，只是推荐做），到2010年，指南中要求做FLT3、NPM1等基因检测，到现在，我们中国国内的指南中，已经出现了要求检测数十种基因的突变。

从原来的单个基因热点区域测序，到多个基因热点区域测序，再到全外显子、全基因组测序，基因越来越多。但是这些基因做完以后，我们具体有哪些能用到疾病的诊断和治疗上呢？

我们现在面临的一个问题，就是技术手段走在了诊断和治疗的前面，临床大夫最直接想要的是，这个检测对我的治疗有什么帮助？对我的病人有什么帮助？但是很多情况下都是，病人花了很多钱，我们做了几十上百个基因，最后只是得到了一个提示，一个模棱两可的结果。

然而，这些不是通过我们个人能力就能改变的，这些疾病相关的靶基因，还有一些靶向药，是通过很多科学家花费几年乃至十几年的时间研究汇总的。但是，我们作为实验室的工作人员，如何在我们现有的能力下，进一步把工作完善、做好，这是一个问题。

我们现在有一个设想就是，我们能不能从单独的这个碱基的ATCG的改变，延伸到去分析整个肿瘤克隆性的改变，去展示更加直观的肿瘤的克隆多样性的情况？






我们知道，本身血液病的发展，就是一个克隆不断演化的过程，从早期的分子学的一些改变，到晚期的一些分子学事件，从干细胞到肿瘤细胞，是不断进展的，这个过程中，每一步都会有一些分子学的标志。






那么，我们能不能把这些分子学的标志，加上我们二代测序所附加的一些数据信息，进行综合分析，让整个报告单看起来更加形象一些？如果有可能的话，我们以后的报告模式，会告诉我们临床大夫，这个病里面有几个克隆？哪个克隆上有什么样的基因？这样的基因对什么样的药有效？这样的就能把一个很枯燥的报告单，让临床医生更好的接受，这是我们想去做的。






二代测序，是一个技术平台，我们能不能把这个技术平台应用到其他检测，我们想到一个就是MRD。MRD有两种释义，一种是最小残留，一种是可检测的最小残留。

可测量的最小残留，就提示我们，可以用不同的方法去检测。目前来说，分子检测是最灵敏的技术，我们可以想想怎么能充分的应用灵敏度高的技术手段，把我们不同技术结合起来，去解决这个问题？

刚才说过，我们做血液病的分子检测，很大程度上受限于基础研究，没有很多明确的靶点可以用来诊断和治疗，但是MRD就不存在这个问题了，我们可以把好的一些技术运用到适当的的情况下，给病人和临床大夫提供一个更可靠的手段，做MRD跟踪。






另外，MRD现在对我们来说不单单是一个技术上的选择，我们更要选择合适的基因，现在血液病上大家都能够达成共识的，觉得非常可靠的可能就是融合基因了，BCR-ABL、PML-RARa，这些致病相关的，都可以作为一个可靠的MRD跟踪的指标。






此外，还有一些CHIP相关，就是白血病前克隆的，DNMT3A、TET2、ASXL1，这些可能在病人中能够检出，但不一定代表肿瘤，随着正常人年龄的增加，这些基因的检出率也会有一些增高。

还有一些遗传易感性的基因等等，在这些基因中，最可靠的就是第一类的融合基因，但是融合基因现在面临一个很现实的问题，就是不是所有人都有融合基因。现在的病人能够用融合基因做来作为跟踪的，在临床上也只是占据20~30%。

所以，现在MRD面临的两个问题，一个是我们需要找到一个合适的检测方法，还有一个就是我们现在监测的范围太小，远远不能满足临床需要，我们需要更多的Marker进行跟踪。






根据这两个问题，我们有一个想法，首先我们病人进行二代测序，能筛到很多的突变，我们统计过二代测序相关基因突变的检出率，在血液病里面能达到90%以上，这在很大程度上解决了Marker较少的问题。

还有一个技术平台的问题，现在二代测序，相对来说敏感度是比较高的，但是还没有远远达到我们对于MRD跟踪的一个要求，这就需要去改变，还是用二代测序这个技术手段，但是变成专门根据MRD去设计的一些高敏感度的方法，这是一个解决的路径。

还有就是，单点的检测，可以用数字PCR，数字PCR有天独厚的优势，就是不需要内参，我们可以根据单点去设计探针，得到检测结果，而且它的敏感性也很高，很有利于我们进行MRD的跟踪，所以这是我们基于MRD跟踪的两个方法。

另外，移植的病人，移植后也需要监测复发。我们以前监测移植，如果存在融合基因，可以根据融合基因去监测，如果没有融合基因，还可以用STR的方法，检测嵌合体的改变。

不过，STR由于本身方法学的限制，敏感度不够，只能达到3~5%，好的时候能达到1%，所以我们就考虑能不能用一个新的方法代替，把敏感度提高，敏感度提高了，就能够帮我们解决MRD跟踪的问题。

我们找到了一个遗传概念：MNP。这个MNP跟STR一样，都是从法医演变过来的，法医上主要是用来对不同来源的核酸进行鉴别，这其中比较关键技术就是，MNP，多核苷酸的多态性。






通常我们知道单核苷酸多态性，就是SNP，它是指一个点、一个碱基的改变，而多核苷酸多态性，它是把不同的SNP位点，进行排列组合，通过排列组合的方式，来识别不同来源的核酸。

这个方法是用二代测序去做的，它利用了多核苷酸多态性的技术优点，又利用了二代的高通量，所以敏感度很高。

原来我们做STR，只做16个位点，排除一些移植前后可能会有差别的基因，也就是10个左右，16个不一定全能用上，而MNP方法，可以把通量放大，可以做100个MNP。所以，从结果来看，不管是从靶点，还是技术平台来说，都能做到高敏感性和高准确性。






这是我们的一些数据，第一列是一个理论值，第二列是同时参考移植前受者和供者的信息以后得出来的，第三列是参考了移植前受者信息后分析得出来的，第四列就是只检测移植后的受者得出来的，就是没有移植前受者信息，也没有供者信息做参考，得出来的，最后一个是STR方法检测出来。






结果发现，用MNP的方法检测的数据，信息基本上是一致的，而且可以达到1/10000的敏感度，而原来STR，在比较好的情况下也只能达到1%，灵敏度能够提高100倍。

下面是一个病例，用STR检测的时候，1月份、2月份都是100%，但是MNP检测，已经发现骨髓里面其实已经有复发的迹象。直到3月份的时候，STR才发现有问题。所以，MNP法比STR法能够提前两个月给临床大夫带来提示，给病人多一份生的机会。














第三个方向就是有点天马行空的想法，我们现在做的测序有DNA、RNA，但是在人体内执行功能的其实是蛋白质，有没有可能在未来应用到血液病的这个分子检测再多一个蛋白组学？

另外，分子诊断与其他的几个诊断模式可能不太一样，分子诊断有它的优势，就是相对来说比较敏感，还有就是高自动化，省时省力，这是对我们个人来说。但是对疾病来说，形态学、细胞遗传学、免疫学，都能给我们带来完整的疾病信息，我们能够看到每个肿瘤细胞上的改变，能够知道细胞长什么样，完整的核型长什么样。






但是分子的话，是大锅烩，所有的细胞放进去以后，是打乱提核酸，造成我们对疾病的认识是割裂的，很多我们说的克隆多样性，其实是不一样的东西混到一块儿了，这是我们分子诊断存在的弊端。


不过，现在我们的技术其实已经达到了，我们可以做单细胞测序，可以做单细胞的蛋白质组学的研究，以后会不会有这种可能，我们能够做到1000个，或者1万个单细胞的测序，或者蛋白质组学的一个测序，通过大数据汇总，给我们一个全新的疾病的解读？当然这是天马行空的想法，不知道多长时间能够实现，





最后，方向四，就是大家提出的宝贵意见！

• 学术沙龙——血液病分子诊断交流会（第一期）
  
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