基于CRISPR-Cas12/13的分子检测技术

虎威将军

分子检测技术在疾病预防和公共卫生领域一直发挥着重要的功能。2003年非典的流行促使RT-qPCR技术称为分子检测“金标准”。近年来爆发的COVID-19传播力更强、隐蔽性更高，对传统的分子检测技术提出了新的挑战。传统的检测技术包括RT-qPCR、等温PCR、测序等，各有局限。RT-qPCR和测序技术对设备、操作人员要求高，等温PCR易非特异性扩增，造成假阳性。因此，研究人员希望开发出一套操作简便、灵敏、快速且廉价的检测技术，以弥补目前技术存在的短板。
CRISPR是一套来源于细菌和古细菌的免疫系统，识别并抵御外源性核酸。研究人员发现Cas12和Cas13家族具备collateral cleavage能力（或称为cleavage in trans），即Cas蛋白-crRNA二元复合体识别并结合底物后，不仅能切割底物，还能切割游离在环境内的任意底物[1][2]。该现象最早被CRISPR先驱Jennifer Doudna和张锋报道。其中，JD团队简单地利用了LbuCas13a的collateral cleavage能力，实现了核酸分子的检测（图1）[1]。不过该系统未经优化，因此检测灵敏度仍存在较大优化空间。



图1 JD团队初开发检测模型

<hr/>2017年，Broad研究所张锋团队和James Collins团队联手开发了SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)技术[3]，正式标志着基于CRISPR的分子检测技术的诞生。开发团队将该技术命名为SHERLOCK（夏洛克），可是取自神探夏洛克之意。SHERLOCK技术流程如图2所示：底物DNA或RNA首先经RPA（Recombinase polymerase amplification）或RT-RPA(Reverse transcription RPA)扩增，提高底物浓度。随后，T7转录酶将扩增后的DNA转录为RNA，并与LwaCas13、crRNA反应液混合。当Cas13-crRNA复合体识别底物RNA后，发生顺式切割和反式切割，collateral cleavage使体系内的ssRNA cleavage reporter断裂。该reporter 5ʹ端连接发光基团，如FAM，3ʹ端连有荧光猝灭基团，如BHQ，因此reporter分子未断裂时，不发出荧光；断裂后，荧光基团和猝灭基团分离，能够发出荧光信号。



图2 SHERLOCK技术流程图

SHERLOCK技术整合了等温扩增技术RPA和Cas13的检测能力，将LoD (Limit of Detection)提升至aM (10^-18 molar, attomolar)级别。时值寨卡病毒和登革热病毒爆发之际，因此团队利用SHERLOCK检测不同来源的病毒分子，结果证明了该技术的鲁棒性（图3）。



图3 SHERLOCK检测寨卡病毒、登革热病毒和细菌基因组DNA

此前的研究表明Cas13a蛋白可以容忍crRNA上有1-2个位点的mismatch，但更多的mismatch会显著降低识别效率。为了将SHERLOCK应用于SNP（single nucleotide polymorphism）位点鉴定，研发团队在crRNA上引入1-2个mismatch，提升系统的灵敏性和精确度（图4）。实验结果显示SHERLOCK识别不同突变体时荧光信号存在显著差异。



图4 SHERLOCK检测SNP

<hr/>2018年，张锋团队对SHERLOCK技术进行了改进，推出了SHERLOCKv2[4]。在本文中，研究团队在以下4个方面进行了优化：

• 多通道检测：团队发现不同家族的Cas13家族具备不同的切割偏好性。基于此，团队可以设计具有不同序列、带有不同荧光基团的报告分子，实现多通道检测平台（图5）。在本文中，团队发现LwaCas13a、CcaCas13b、LbaCas13a和PsmCas13b分别偏好AU、UC、AC和GA序列（图5B），因此4-channel检测平台被开发出来（图5D）。此外，特异性切割DNA的AsCas12a蛋白也被引入进来，因此，同时检测DNA和RNA的4-channel检测平台被成功搭建（图5E-H）。
  

图5 Multiplex channel

2. 定量：SHERLOCK只能对核酸分子进行定性分析。在这里，团队尝试不同浓度的引物，发现当引物浓度为240nM时，荧光信号和底物浓度表现出最强的相关性（图B, C），因此团队可以依靠荧光值对底物进行定量。
3. Csm6增强检测灵敏度：Csm6蛋白是来自Type III家族的核酸酶，能够被Cas13蛋白切割产物2&#39;,3&#39;-环状磷酸酯激活。因此，团队在体系内引入Csm6，提升了LoD 3.5倍（图6D-G）。



图6 单分子定量和Csm6增强

4. 横向流动测试：研究人员希望摆脱仪器限制，以更直观、更便捷的方式呈现结果，因此团队开发了lateral flow strip。在该系统中，报告分子两端连有发光基团FAM和生物素biotin。研究人员将样品滴在sample pad上，经毛细作用，向absorption pad流动。在流动过程中，报告分子与anti-FAM金纳米颗粒结合，若未发生切割，5&#39;FAM-3&#39;Biotin-anti-FAM-gold-NP被链霉素亲和素streptavidin捕捉，形成第一条条带（control band）；若发生切割，则5&#39;FAM-anti-FAM-godl-NP会被二抗结合，形成第二条条带（sample band），而无法被streptavidin捕捉。
研发团队利用横向流动测试检测ZIKV，发现检测灵敏度在2aM（图7b，c）。此外，团队还将横向流动测试应用于SNP位点检测，实验结果表明该方法的有效性（图7E-L）。



图7 lateral flow strip

<hr/>除了张锋团队卓有建树外，诺奖得主Jennifer Doudna也基于LbCas12a开发了检测系统，并将其命名为DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)[5]。与SHERLOCK类似，DETECTR整合了RPA扩增技术和和Cas12a检测能力。与SHERLOCK不同的是，Cas12a的collateral cleavage能力是针对ssDNA的，因此reporter分子是ssDNA。JD团队利用DETECTR成功检测HPV16和18株（图8）。DETECTR与SHERLOCK检测能力相近，都达到了aM级别。



图8 DETECTR原理示意图

<hr/>同年，JD团队从未获得培养的古细菌中发掘了分子量更小的Cas14蛋白（大小在400-700 aa），并基于Cas14开发了Cas14-DETECTR检测系统[6]。团队研究发现相比于Cas12，Cas14对crRNA的mismatch更为敏感，团队也利用Cas14-DETECTR系统成功区分HERC2基因的两种突变体（图9E）。



图9 Cas14-DETECTR

另外，中科院武汉植物园钟彩虹团队改造crRNA，证明此前切割能力不明的Cas12c蛋白也具备顺式切割和反式切割特性。该团队基于Cas12c1、Cas12c2和OspCas12c开发了Cas12c-DETECTR检测系统，进一步扩宽了分子检测工具箱[7]。
<hr/>值得一提的是，就在Jennifer Doudna团队研究DETECTR同期，中科院上海植物生理生态研究所王金团队也基于Cas12a开发了核酸检测系统，并命名为HOLMES (an one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)[8]，与SHERLOCK遥相呼应。在这里，团队并未采取等温扩增技术RPA，而是利用传统的PCR技术（图10）。团队在10种Cas12a蛋白内筛选，找到了信噪比最高的LbCas12a蛋白（图10B）。不结合PCR时，Cas12a检测限度为10^8 aM；经PCR扩增后，LoD达到10^1 aM（图10C）。类似的，团队也成功利用HOLMES进行基因分型（图10 E）。



图10 HOLMES原理示意图

<hr/>在HOLMES中，团队利用传统的PCR对底物进行扩增，这对仪器要求较高。为了简化仪器要求，王金团队在2019年开发了HOLMESv2[9]。在此，团队利用等温扩增技术LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)扩增底物，并利用嗜温AacCas12b蛋白检测。经检测，团队发现HOLMESv2灵敏度达10^-5 nM (nanomolar)，比之SHERLOCK和DETECTR略有不足。



图11 HOLMESv2

<hr/>传统的检测技术“金标准”RT-qPCR均对设备和人员要求高，不易开展即时检测（POCT，point of care testing）。传统的PCR技术需要变性、退火和延伸步骤，对设备要求高。一代和二代测序技术对设备、人员要求高，且耗时更长、价格更高。等温扩增技术如RPA、LAMP等相对简单便捷（RPA只需37℃，而LAMP只需65℃），但易产生非特异扩增和假阳性。基于CRISPR的核酸检测技术是目前最具前景的诊断手段，具备操作简便、耗时短、价格低廉等优点。当然，CRISPR分子诊断技术并非完美，该技术依然面临着精确性、灵敏性、通量和交叉污染等局限性，因此大量优化实验仍亟待开展，促进该成果落地。
参考

• ^abTwo distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection
  
• ^C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector
  
• ^Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2
  
• ^Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6
  
• ^CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity
  
• ^Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes
  
• ^Cas12c-DETECTOR: A specific and sensitive Cas12c-based DNA detection platform
  
• ^CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection
  
• ^HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation
  

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