pcr原理是什么？

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pcr原理是什么？
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长长的路

PCR 技术是一种对特定的DNA 片段在体外进行快速扩增的方法，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA 合成，在设计上十分简单并且似乎有无限的应用方式（《PCR 技术试验指南》美国）。
除了简便外，还具备高效、快速、灵活和易于操作的特性，这一技术已经迅速地扩展到其他领域，例如临床诊断、微生物检测、法医物证鉴定和食品安全检测等，是目前分子生物学中应用最为广泛的一项技术。
PCR 技术原理类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，通过变性- 退火- 延伸三个基本步骤完成：
变性步骤使得模板DNA 双链或者PCR 扩增形成的双链DNA解离，成为单链，变性温度一般在93 °C 以上；退火步骤使得单链DNA 模板与序列互补的引物配对复性，退火温度与引物的Tm 值相关；延伸步骤使得DNA 模板- 引物结合物在72 °C、DNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为底物，靶序列为模板，按照碱基互补配对和半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 互补的半保留复制链。
重复循环以上三个步骤就可以获得更多的半保留复制链，而新链又可成为下次循环的模板，即扩增产物呈现指数增长，直至反应体系中的某个组分变为限制因素为止，产物不再按照几何方式积累，逐步进入PCR 反应平台期。



PCR 指数扩增理论



PCR 虚拟扩增曲线(Eppendorf 2012)



典型PCR 程序 http://www.baike.com/wiki/PCR

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Eppendorf 实验室

清风寡欲

PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。
PCR包含下列三步反应：
1、变性(denaturation)
将反应体系混合物经加热至94℃左右，维持较短的时间，使双链DNA变成单链DNA，便于下一步引物的结合。
2、退火(annealing)
将反应体系温度下降到特定温度（一般是引物的Tm值以下)，引物与DNA模板以碱基互补的方式结合，形成模板-引物杂交双链。退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。由于引物结构简单，加之引物量远远大于模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间的互补结合很少。
3、延伸(elongation)
将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间，在Taq DNA聚合酶的作用下，以引物为起始点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，从5'→3'方向延伸反应，合成新的DNA双链。
以上三步反应为一个循环，重复进行变性、退火、延伸这三步反应，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。上述过程1.5小时左右完成，从而使所需的目的DNA片段扩增放大百万倍。
PCR（聚合酶链式反应）技术普及度较高，适合已知基因靶点和对检测效率要求较高的检测，因其“简便、快捷、性价比高”的属性被广泛应用于医学检验、法医鉴定、食品安全等领域。在过去的数十年间，PCR已被确立为多种疾病的标准诊断方法，在COVID-19疫情期间，PCR亦被认可为诊断是否感染新冠病毒的“金标准”。

dPCR虽然优点显著，但是对于多靶点（target site）的检测却存在着明显的限制。
首先是PCR-base技术的共性问题：非特异性扩增引起的不同靶点扩增互相干扰（一般极限值是20个）、阴性阳性信号分辨率不足等。在尝试增加检测通量时，dPCR通过信号强度区分有极限，通常以区分阴阳性为主，通过设计最多一般只能区分强阳、中阳、弱阳和阴性。此外，由于大多数平台的多重荧光通道只允许每个荧光通路识别一个目标。通过多荧光通道加持实现扩大检测靶点数，最多也只能同时进行6-8个靶点的检测，而且会造成检测系统成本的增加。为了解决dPCR信息通量低的问题，创新性研发了“高通量PCR”技术平台，相对于传统PCR技术，高通量PCR在dPCR高灵敏度核酸定量检测的基础上，单管可同时检测上万重靶点。

清风寡欲

PCR的原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
PCR最有价值的应用领域就是对感染疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。扩展资料
标准的PCR过程分为三步：
1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

同花顺

一、实验目的： 掌握PCR反应的基本原理与实验技术
二、PCR反应​实验原理
   PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.
2. 退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.
3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA。
   上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
    典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTPs、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
三、 试剂和缓冲液
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模板。
四、 仪器耗材
PCR仪，掌上离心机，微量移液器，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒。
五、 实验步骤（每人一组，每人做1管，纯化时两人一组）
1. 查找基因序列，设计合成PCR引物。注意合成引物约需一周时间，请提前准备。详细步骤请参考实验一后面的附件内容。
2. 在50μL反应体系中，加入：
　　　　模板DNA (5ng/μL)        1   
　　　　引物P1P2(10μmol/L)    各1   
　　　　2×PCR mix              25
　　　　ddH2O                  22
在冰上配制，注意混匀后离心。加入10μL石蜡油覆盖。
3. 在PCR仪中预变性94℃ 4min，然后循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；循环结束后，72℃10min 。扩增的PCR产物4℃保存。（OC-II）
4. 取PCR产物2-5μL与上样缓冲液混合，点样。
5. 1% 琼脂糖胶电泳，160V 30-40min。
　　6. 电泳结束，溴化乙锭染色5-10分钟。
7. 用凝胶成像仪观察、拍照。
8. PCR产物切胶回收。步骤参见胶回收Kit说明书。
A酶切片段的纯化及其回收
使用切胶回收kit进行PCR产物的回收。具体操作步骤如下，详见说明书。
1）称回收的胶，每0.1g加100µLXP2 ；
2）55度5-7分钟至完全溶胶 ；
3）取溶胶液加入回收柱子，最大体积700µL；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ，10000g 1min；
5）加700µl SPW ，10000g 1min；
6）重复5）；
7）空管离心2min，13000 g
8）干燥，加15-30µL  Eulation Buffer
9）13000 g，1min

DNA产物纯化kit，操作步骤：

• 将PCR反应液（40ul）或酶促反应液移至一干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的buffer3，充分混匀。（用前确定加入适量的异丙醇）
  
• 将混合液全部移入吸附柱，8000g离心30s；将滤出液再次加入到吸附柱中再次过柱，8000g离心30s（此步骤可以提高回收效率）；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
  
• 向吸附柱中加入500ul Wash Solution（加到壁上），9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。（Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇）
  
• 重复步骤3一次
  
• 将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。下管扔掉，上管放入1.5ml离心管中，晾干。（残余的乙醇会严重影响得率和后续试验）
  
• 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前预热（进一步提高得率）的Elution Buffer（加到滤芯上），室温静置1min，9000g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
  

注意：本步骤中，所有转速单位为g。
B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法对PCR产物回收。具体操作步骤如下。

• 加入等体积的冰无水乙醇，加入1/10体积的KAc（3M  pH5.2）。
  
• 上下颠倒混匀，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。
  
• 弃上清，加入70%的冰乙醇，轻轻混匀。12000r/min 4℃离心10min。
  
• 弃上清，室温干燥，至无乙醇。
  
• 加入适量体积的ddH2O。
  

六、注意事项
1. 进行PCR反应时，注意加入试剂的顺序。注意加入任何一种试剂后均需混匀。
2. 本实验使用2xPCR mix，包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀释：分子量24bp*324.5 = 7788，质量数10OD*33 ＝33ug，摩尔数=33/7788 =4.2 nmol，母液浓度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L，使用时取母液稀释5倍，则终浓度为10μmol/L。
4. PCR扩增产物共20μL，其中2-5 μL用于检测，剩余的用于纯化回收。
5. 使用自己的实验材料进行PCR扩增的学生，请提前准备引物和模板。

附1：基因序列查找和PCR引物设计
实验课进行之前，需要利用NCBI查找基因序列，并设计PCR引物。

• 进入NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）后，在Search的下拉框中选择Nucleotide，再输入基因名称，点击Search即可。也可输入具体的物种名以缩小范围，获得cDNA 序列信息。
  

例如：水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（Oryzacystatin, OC）序列信息
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA

• 引物设计。要求扩增上述完整的cDNA 序列，并在两端添加酶切位点，5‘添加EcoRI（GAATTC）， 3‘端添加HindIII （AAGCTT）。以便克隆到pET30a的相应位点。
  

注意PCR产物中没有上述酶切位点，否则不能使用。
prim-OC2-R   GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC    26bp  下划线为EcoRI识别序列
#prim-OC2-F   GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC    26bp  下划线为HindIII 识别序列

T载体通用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
苏州阿尔法生物的实验室仪器主要包括微量移液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽设备。

感恩由您

⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。