一文讲清楚：Annexin V凋亡实验注意事项

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Annexin V是检测细胞早期凋亡的常用方法之一。实验操作虽然不算难，想要获得漂亮的流式结果图却并不容易，任何一个细节的疏忽都可能导致实验结果不理想。
本篇文章，带大家了解实验过程中的注意事项，及不能忽视的实验细节。
01 实验原理
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力特异性结合。在细胞凋亡早期，只分布在正常细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）翻向外侧，用标记了荧光素的Annexin V作为荧光探针，并搭配PI、7-AAD、DAPI等核酸染料使用，能够准确区分正常细胞、凋亡早期和凋亡晚期细胞。



图1：Annexin V 检测原理

02 实验结果展示



图2：Annexin V-FITC/PI（E-CK-A211）实验结果展示

03 实验中需要注意的细节
a. 样本制备方面：
（1）贴壁细胞要尽量使用不含EDTA的胰酶进行消化。如果一定要用含EDTA的胰酶，终止消化后，要将细胞洗涤干净，尽量去除EDTA。
（2）比较难消化的细胞、组织等样本，可以分批次消化，避免先消化下来的细胞被过度消化，导致假阳性结果。
（3）机械力会损伤细胞，操作过程中的任何暴力行为，都会使细胞本身凋亡百分率变高。要想实验结果好，尽量少吹打细胞，因为每个细胞都值得被温柔以待!
b. 实验设计方面：
流式实验的对照设置一直都很令人苦恼，那Annexin V实验中的对照又该怎么设置呢？每个对照的作用都是什么呢？整理出相关表格供大家参考：
表一：Annexin V 凋亡实验流式上机对照设置

组别	Annexin V	核染料	样本类型	作用
空白对照	-	-	不做任何处理的细胞	确定仪器阈值调整细胞的位置
生物学对照	+	+	不做任何处理的细胞	排除操作对实验结果的影响，辅助设门，判断处理是否有效
单阳对照1	+	-	有明显凋亡的细胞	调节补偿及通道电压
单阳对照2	-	+	有明显凋亡的细胞	调节补偿及通道电压

注意事项
① 单阳对照组细胞，一定要使用确定有凋亡的细胞，因为调节补偿需要有足够的阳性信号。
② 如果细胞带自发荧光，空白对照和单阳对照需要用不带自发荧光的细胞，另外需要再增加一管带荧光但不加任何染料的细胞做单阳对照。
细胞带绿色荧光（如：GFP）
可以根据流式细胞仪的配置来选择合适的试剂盒：
·流式细胞仪有DAPI通道，选择Annexin V-APC/DAPI(E-CK-A258）试剂盒；
·流式细胞仪没有DAPI通道，选择Annexin V-APC/7-AAD(E-CK-A218)试剂盒。

细胞带红色荧光（如mcherry/RFP）可以选择Annexin V-APC/DAPI(E-CK-A258)试剂盒。
c. 数据分析方面：
想要获得好的实验结果，数据分析也是非常关键的一步。那我们数据分析该怎么做呢？总结下来无外乎仪器设置、调节补偿、设门几个方面。
仪器设置
仪器设置主要是阈值和各通道的电压两方面。阈值需要合理，不能过大也不能过小。
阈值过大：可能导致凋亡信号被过滤掉。因为部分细胞凋亡时，细胞会发生皱缩，FSC比正常细胞小（图3红色框部分），阈值过大会导致这部分信号收集不到；
阈值过小：会导致收集的细胞大部分是细胞碎片（图4）。



图3：Annexin V实验结果（FSC/SSC结果图）



图4：阈值设置过小结果展示

各通道电压也需要合理设置，保证信号在仪器接受范围内，保证信号不压线。



图5：电压设置不合理右侧信号压线展示（红色框）

补偿
补偿的调节是因为荧光之间存在光谱重叠的现象，需要把目的通道里接收到的干扰信号去掉，确保实验结果的可信度。补偿可信度的基础是好的单阳对照，所以我们前面在实验设计里提到的单阳对照一定要做好，确保单阳管里有足够的阳性信号。



图6：补偿前后对比

设门
Annexin V实验通常情况下细胞分群比较明显，设门其实不复杂——在FSC/SSC图上圈出目的细胞群，注意细胞碎片的位置，调整好补偿后画十字门，结合对照组微调十字门的位置。
在FSC/SSC图上圈目的细胞群的时候要注意：有部分细胞可能会因为凋亡发生明显皱缩，FSC会比正常细胞小一些（图7左侧部分），这部分信号也要圈进来，避免凋亡信号丢失，导致实验结果出现偏差。



图7：FSC/SSC设门示意图

以上是为大家分享的Annexin V凋亡实验过程中的注意事项，及不能忽视的实验细节。下期会带来具体的分析案例，敬请期待~


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