IVD的原料、工艺和思路

营养师

在体外诊断试剂产品性能评估，原料占70%，工艺占20%，思路占10%。
        按《体外诊断试剂分析性能评估指导原则》，主要的分析性能评估项目有：检测限、线性范围、可报告范围、准确度（回收实验）、准确度（方法学比对）、精密度、干扰实验、稳定性、参考值。目前国际上通常是以美国临床实验室标准化组织（CLSI）的相关标准为依据。
        产品性能评估是产品研发、制定产品标准等过程的重要技术支持研究过程，并可能对产品质量造成一定影响。在整个研发过程中，涉及原料、工艺和思路，因为行业处于黄金发展阶段，很少去关注和优化整个研发流程，如果没理顺这三者关系，整个研发流程会陷入盲目与不可持续。
        刚接触研发时，一般是以现有体系，包含稳定的配方体系（包被缓冲液、封闭缓冲液、酶标缓冲液、校准品稀释液、发光底物液）和工艺流程，一切就着拿来主义，用已有的配方，就着已有的工艺，按着流程操作，多数工作用于筛选配对，分析数据。
        这个入门阶段，一般至少维持2-3年，因为配方体系和工艺体系（以下简称工艺，包含配方和体系）是前人通过大量研究成果而建立的，一般比较稳定，较少修改（就算要改进，权限也是在研发总监手中），加上整个研发思路已经流程化，不用思考太多。很多新技术员，通过这种配对筛选后，会从一定数量的配对中筛选出比较合适的配对，进行下一环节研发，很容易就得出，一个试剂盒好坏，基本取决于原料质量，如果没有筛选到好原料，或者碰到难项目，就无从入手。
        我们将原料、工艺和思路，细细拆解来分析，目的是理清性能评估项目中，哪些项目是原料决定的，哪些项目是工艺决定的，哪些项目是两者共同影响的，促进研发思路的形成与成熟，希望能够抛砖引玉。
        一．原料
        我们将免疫试剂中关键原料提炼出来，分为两块：抗原抗体和特殊成分。
        1、抗原抗体 免疫试剂一般可以分为两个过程：免疫反应和显色反应。免疫反应是核心，将待测物特异性地从复杂样本中分离出来，这一环节的好坏，直接决定整个试剂的核心质量。
        在工业生产上，免疫检测用的抗体，一般是通过工程菌表达抗原片段，免疫动物，进行多克隆或者单克隆抗体制备，然后得到的抗体，进行配对筛选，选出合适的配对应用于免疫检测。在这个过程中，由于待测抗原一般都是天然抗原（少数科研检测重组抗原），而制备和筛选抗体一般又是使用重组抗原，因此会带来很多应用问题，这个对抗体制备商来说，值得重视。
        2、特殊成分 免疫反应做为一个脆弱的非共价键结合过程，整个反应受时间、干扰物、桥联物、结构类似物等影响，为消除这些不良影响，一般在缓冲体系中会增加一些特殊成分，这些特殊成分我们定义为次要原料，在工艺中详述。
        二．工艺
        工艺包含配方体系和工艺流程，两者相辅相成。所有的配方和工艺，是为保障和提高产品性能而设计的，当原料无法满足产品性能要求时，如何通过配方工艺来提高，或者说，哪些性能能通过配方工艺来提高，如何来提高，哪些只能由原料决定，这个在我们研发职业生涯中，要不断积累与完善。
        1、配方体系  配方体系可以拆解为缓冲体系和改进体系。
       （1）缓冲体系 一般的缓冲体系，在教科书、产品说明书、论文中均可见到，主要包含离子对类型、离子浓度、pH值等内容，非保密配方，比较容易理解与掌握。
       （2）改进体系 因为免疫反应的非共价键结合的脆弱性，依靠一个简单缓冲体系，要获得很好的反应结果，是比较困难的，针对这种问题，科学家设计了各种改进体系，这些体系下面，又有各种方法产生。
        A、降低本底体系
          a、使用合适的包被、标记浓度，一般采用棋盘滴定确定。
          b、加入增加溶解率，降低非特异吸附的物质，如曲通、吐温。
       B、减少干扰体系
          a、加入正常鼠血清或者鼠IgG，降低人抗鼠抗体影响  
          b、加入阻断剂，降低类风湿因子干扰
       C、减少前带效应体系
          a、适当提高包被和标记浓度，兼顾本底
          b、加入检测抗体裸抗，兼顾灵敏度
       D、增加灵敏度体系
          a、加入曲通、吐温等
          b、加入特殊物质，如S19
       E、提高检出率体系
          a、多个抗体联合使用，如CnTI项目
       F、提高稳定性体系
          a、缓冲液加入保护性蛋白、糖类、小分子化合物
      G、等等其他体系 随着研究深入，这个目录会不断增加，相应的方法也会不断增多。
        2、工艺流程 工艺流程，又包含生产工艺流程和试剂盒检测操作工艺流程两个方面。
      （1）生产工艺流程 生产工艺流程，对整个的产品性能，有非常大的影响，比如预包被板制备工艺，包被、封闭、干燥的温度、时间，对整个性能影响很大，需要研发摸索。
      （2）检测操作工艺流程 相比生产工艺，试剂盒的检测操作工艺，对性能影响更大，一步法、两步法，加样量，加样顺序，温育温度，温育时间。
        三．思路
我们分析原料与工艺，就是为了找到一个合适的研发思路，指导研发过程，提高研发效率，整个研发思路，我们再划分为产品研发和改进研发两个问题。
        1、产品研发 产品研发是一个从无到有的过程，多数是根据市面上已有的试剂，研发自己公司没有的产品。这个过程占研发的大头，我们再将其细分为初步研发、预临床实验和稳定性测试三个过程。所有的研发，我们都必须知道，一个性能项目，他是怎么评估的，哪些因素会影响这个性能，如何改进，我们以双抗体夹心为例列举。
       （1）初步研发 初步研发时，一般重点强调三个活性成分：包被抗体、检测抗体、校准品。包被抗体和检测抗体，会有一个经验浓度，校准品一般用合适基质，将抗原或者高值样本进行梯度稀释，获取的梯度浓度进行第三方赋值，追溯到国际、国家或者企业标准品。
        初步研发多数是在做配对筛选，只需要用检测限、线性范围、可报告范围这三个性能评估项目，即可筛选出候选配对。比如拿到10株抗体，可以做成100个配对，进行筛选，选出初步可用的候选配对若干对。
        对初筛的候选配对，进行精密度、准确度（回收实验）、干扰实验评估，通过这些实验，再二次筛选候选配对。
     （2）预临床实验 不涉及临床血清样本的初步研发都完成后，获得一定的候选配对，进行预临床实验，主要是评估准确度（方法学比较）和参考值区间。
（3）稳定性测试 通过上面两个步骤，试剂盒初步成型，活性组分（包含预包被板、校准品、酶标抗体）的稳定性，需要一一评价与改进，直到满足要求。
2、改进研发 整个试剂盒的研发，最终就是为了检测临床血清样本，所有的分析性能评估项目，也是为这个目的而设计，但是在整个研发过程中，不管是预临床试验，还是正式临床试验，配对测试的临床血清样本量，是非常有限的，顶多就算是完成一个小试生产。到真正产品上市和临床应用时，随着样本量的扩大，很多之前没有暴露的问题，都会集中暴露，必须收集足够数据，进行改进研发。
一般这个阶段，就是针对临床不符合的样本，特别是假阳性、假阴性样本，要对样本进行不同厂家试剂检测比对，成分分析等等，这个过程在预临床和正式临床都会做，在预临床和正式临床时，还要对检测值严重不符，但并未导致假阳、假阴性的样本，进行分析。

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