从零开始学PCR技术（二）：PCR引物设计

病理医师

扩增子测序在临床基因检测中有广泛应用，合理的Panel设计非常重要，而Panel设计最终要落地，精心设计引物就是重中之重了。
本文通过公开资料整理而成，志在让外行了解一些引物设计的基础知识，深入研究请参考专业文献。本文仅供学习参考，不构成任何具体建议。
背景：DNA热力学

DNA热力学是指温度影响双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的核酸结构。这部分知识是难的，但如果不深入了解，引物设计过程中可能会犯许多错误。
一些基础概念：
杂交： 正常情况下，寡核苷酸、DNA或RNA会绑定到其互补序列，互补序列的碱基之间通过氢键连接，最常见的是，核酸碱基对以A = T和G≡C的方式成对形成，其中后者更稳定(由于氢键数较多)。



溶液中的DNA，图片来源于网络，侵删

变性：又称DNA解链或融化，是DNA双链因为加热温度升高或者化学物质的诱导变成单链的过程。我们把DNA双链解开一半时所需要的温度称为融点（Melting temperature, Tm）。Tm依赖于DNA分子的长度及其特定的核酸序列组成。
复性：又称退火。单链DNA或RNA与互补的探针或引物结合形成配对的双链核苷酸的过程。
关于PCR的7个谬误及改进办法

Myth 1: PCR Nearly Always Works and Design Is Not that Important

谬误1：PCR随便弄就行了，反正都能工作。
有些时候或许确实如此，尤其是一重PCR的时候，但如果是多重PCR就必须要精心设计了。
Myth 2: Different Methods for Predicting Hybridization Tm Are Essentially Equivalent in Accuracy

谬误2：随便一种方法预测寡核苷酸的Tm值准确性都差不多。
计算Tm最简单的公式是：
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)
这个等式忽略了许多重要信息：Tm值依赖于链的浓度，盐分浓度以及碱基序列。这个公式得到的Tm通常比实验测得的高15℃。因此并不推荐使用，一个更好的公式是：
Tm = 81.5C + 16.6 × log10[Na+]+0.41(%G+C)–0.63(%formamide)–600/L
其中L是双链DNA的长度。
Myth 3: Designing Forward and Reverse Primers to Have Mathing Tm's Is the Best Strategy to Optimize for PCR

谬误3：很多老手都相信这一点：优化PCR设计时，最好让上下游的引物都具有接近的Tm。
许多软件也是基于这一策略设计的。但这是有缺陷的，用ΔG°比Tm要好。
Myth 4: "Primer Dimer" Artifacts Are Due to Dimerization

谬误4：引物二聚体只是引物的二聚化。
常见导致引物二聚体的因素有：3'端互补，5'端或中间序列互补，高循环数（>35），掺入外源基因组DNA，引物结合靶DNA的效率低，使用具有校正活性的DNA聚合酶（Pfu等）因3'外切活性可能使原本不匹配的3'端互补。
Myth 5: A BLAST Search Is the Best Method for Determing the Specificity of a Primer

谬误5：BLAST搜索是检验引物特异性的最佳方法。
事实上，热力学参数比序列相似性能够更好地预测引物特异性。
Myth 6: At the End of PCR, Amplification Efficiency Is Not Exponential Because the Primers or NTPs Are Exhausted or the Polymerase Looses Activity

谬误6：PCR平台期的出现是因为引物或dNTP耗尽，或者酶失去活性。
实则不然，真正导致平台期的原因是积累的dsDNA产物的抑制，这已经得到了实验证明。
Myth 7: Multiplex PCR Can Succeed by Optimization of Individual PCRs

谬误7：可以通过优化单重PCR来优化多重PCR。
设计良好的单重PCR确实有助于开发多重PCR，但如果只使用这种策略则过于简单。还需要使用软件而不是人工来协助设计。
PCR引物设计原则

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
1. 引物设计基本原则

• 引物长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
  
• 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
  
• 引物Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽；
  
• 扩增子Tm：>92℃；
  
• 3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
  
• 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
  
• 末端2bp最好为GC；
  
• 引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
  
• 其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。
  

基于上述原则，怎么在实践中应用呢？这要分两种情况：
(1) 基因克隆PCR引物设计
这种情况我们往往并没有太多选择，只能从ATG开始，从TAA等结束，什么GC%、二聚体和错配，可能根本由不得我们。既然起点定了，那只能通过改变长度来匹配最优设计要求了。  
(2) 鉴定PCR引物设计
我们只需要确认一段DNA序列上的一部分，起点是相对的，我们可以在整个序列范围内搜索，引物设计的灵活性大大提高，当然搜索时间也要增加。
2. 引物设计软件

• Primer Premier5.0 （自动搜索）
  
• vOligo6 （引物评价）
  
• vVector NTI Suit
  
• vDNAsis
  
• vOmiga
  
• vDNAstar
  
• vPrimer3 （在线服务）
  
• ThermoBLAST
  

参考文献

• PCR Primer Design, 《Methods In Molecular Biology》第402卷
  
• PCR Primer Design来自于2009年第3卷（doi:doi:10.1101/pdb.ip65）
  
• Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design(10.5897/AJB2003.000-1019)
  
• 临窗听风雨：PCR引物设计大法
  
• 百度百科：聚合酶链式反应
  

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