pcr能干什么？什么时候需要用到pcr？

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pcr是做什么用的啊，通过pcr我们可以得到什么结论呢，为什么很多实验都要用pcr？

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一、 聚合酶链式反应
聚合酶链式反应 (PCR) 是扩增由 RNA 创建的 DNA 或 cDNA 靶标以创建特定基因组区域的数百万个副本的过程。该过程可以检测多种基因组变异，包括单核苷酸变异 (SNV)，也称为体细胞点突变、缺失和插入、拷贝数变异和基因融合，具体取决于检测设计。该技术可用于通过终点 PCR 定性或通过定量 PCR（qPCR 或实时 PCR）定量检测单个反应（多重 PCR）中的单个已知靶标或多个靶标。



朗基PCR仪

朗基PCR-PCR仪价格-荧光定量PCR仪所有 PCR 反应都需要双链 DNA 或 cDNA 模板、短目标基因特异性寡核苷酸引物、DNA 聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸碱基 (dNTP)、缓冲液、KCl 和 MgCl 2。模板包含要分析的所需核苷酸区域，并且必须是双链的。为了通过 PCR 扩增单链 RNA，必须首先将其转化为双链 cDNA 分子。这个过程称为逆转录酶 PCR (RT-PCR)，需要逆转录酶 (RT)、靶向寡核苷酸以及 PCR 反应中使用的相同缓冲液和试剂。靶向寡核苷酸可以是针对感兴趣的 RNA 靶标的特异性，或更常见的是，普遍结合所有 RNA 以创建完整的 cDNA 文库。这些通用寡核苷酸通常是一系列随机六聚体或靶向 mRNA 的聚 A 链。一旦寡核苷酸与RNA杂交，
除了适当的双链模板外，每个 PCR 反应还必须包含位于感兴趣区域侧翼的寡核苷酸引物。根据下游应用，可以考虑对引物进行额外的设计修改，包括添加荧光团。热稳定性 DNA 聚合酶有助于添加核苷酸碱基以延伸引物，从而形成模板的副本。添加的缓冲液维持反应的 pH 值，KCl 有助于正确的引物杂交，MgCl 2增强聚合酶活性。
PCR 反应发生在自动热循环仪内，由温度依赖性变性、退火和 DNA 合成的重复循环组成。在变性步骤中，DNA 双螺旋通过在高温 (>94°C) 下使键变性而断裂，产生两条单链 DNA 模板。然后降低温度以使寡核苷酸引物和探针与DNA链退火。一旦退火，DNA 聚合酶就可以开始催化新 DNA 链的延伸。该温度循环重复设定的次数，具体取决于下游应用所需的扩增量，结果是目标序列或扩增子的 2  N个拷贝，其中 N 是执行的循环数（图 1）。



聚合酶链式反应

检测和分析这些 PCR 产物的过程取决于预期的下游应用。本综述将进一步讨论一些常用的应用，包括 qPCR、片段分析（桑格测序）。
二、荧光定量PCR
一些应用，包括识别差异甲基化、对已知单核苷酸变异进行基因分型或量化基因融合转录本，需要准确确定源样品中存在的靶序列的量。为了实现这一点，qPCR 化学依赖于使用添加到先前描述的 PCR 反应中的荧光标记寡核苷酸探针。这些探针设计用于在扩增的目标区域内杂交，从而提高 PCR 反应的特异性。当荧光团吸收特定波长的光能时，它同时发射比 qPCR 仪器可测量的波长更低的能量。 45 qPCR 不是在 PCR 反应结束时检测荧光量，而是在每个 PCR 循环结束时读取荧光，从而实现目标指数扩增的可视化。为了解决循环过程中未结合探针的非特异性荧光问题，这些探针的设计利用了荧光共振能量转移或 FRET 的原理。FRET 的主要机制是当一个荧光团靠近时能量从一个荧光团转移到另一个荧光团。
探针设计根据 qPCR 测定的化学性质和预期的下游应用而有所不同。然而，临床实验室采用的一种常见 qPCR 方法利用了 Taq DNA 聚合酶固有的 5' → 3' 核酸外切酶活性。qPCR 探针末端标记有两个荧光团、一个报告基团和一个淬灭基团。当探针完好无损时，这些荧光团被大约 20-25 个碱基对分开，从而导致能量转移。报告分子的发射波长激发猝灭剂，通过消除任何残余能量并防止其被检测到，有效地沉默报告分子。然而，在 PCR 反应过程中，当 Taq 聚合酶复制模板链时，它将取代并降解分隔报告基团和猝灭基团的 qPCR 探针。在 PCR 循环结束时，将获得读数，所有自由报告器将发射检测到的波长，而剩余的完整探针将保持沉默。荧光信号将呈指数增长，直到其中一种试剂耗尽，此时每个循环将不再导致目标加倍（图 2）。



PCR荧光定量

Taqman 定量聚合酶链反应 (PCR)。(A) 引物和探针退火至互补序列。寡核苷酸探针用荧光团 (R) 和荧光猝灭剂 (Q) 标记。在 PCR 延伸步骤中，Taq 聚合酶的 5' 核酸外切酶活性消化探针，导致 (R) 从 (Q) 中释放，从而允许报告基因的荧光检测。(B) 每个循环结束时实时检测累积荧光，以便计算比较模板数量。



PCR荧光定量仪

要计算存在的起始拷贝数，必须将原始样本与已知标准进行比较。使用达到预定荧光阈值（ C t或C q）值所需的循环数来比较样品和标准品的扩增曲线。该阈值必须位于所有曲线的指数生长期内，并且取决于用于测定的引物和探针。通过测定已知标准品的Ct 值可以生成标准曲线。C t​然后可以使用已知标准的值来确定曲线并通过与起始材料中靶标的相对量进行比较。此类分析的变化使得使用 RNA 转录本监测肿瘤负荷和融合的微小残留病等情况成为可能。
这些类型的分析也已被采用到半自动化和全自动平台中，例如 Biocartis Idylla™，从 FFPE 样品到结果大约需要 2 小时。

三、 毛细管电泳片段分析
PCR产物的定性检测是通过扩增核酸靶标的电泳来实现的。简而言之，在核酸电泳中，将电流施加到带负电的 PCR 产物上，导致产物迁移通过粘性介质，从而实现 PCR 产物的大小分离。这些原则已在其他地方详细介绍。  在实验室中，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳已很大程度上被毛细管电泳所取代。这些仪器通常包含多个毛细管 (8-96)，其中填充有粘性基质，可以实现精确的尺寸分离，并且可以更轻松地缩放到实验室所需的应用和体积。体细胞应用包括检测致病性缺失和插入、 通过限制酶消化检测致病性变异的存在、 等位基因特异性 PCR、 和桑格测序。



桑格测序原理

四、桑格测序原理
  桑格测序可以分析大小约为 300-1000 个碱基对的基因组区域。PCR 扩增后，纯化的 PCR 产物进行测序反应，其中包括酶、缓冲液、测序引物以及 dNTP 和荧光标记的双脱氧核苷酸 (ddNTP) 的混合物。当酶工作以创建 PCR 模板的副本时，dNTP 或 ddNTP 会并入延伸链中。当添加 ddNTP 时，它会阻止随后添加 dNTP，导致在称为双脱氧链终止的过程中终止延伸链。此过程会创建 DNA 片段文库，其中片段在序列的每个碱基处终止。然后通过毛细管电泳分析该片段文库，并鉴定每个片段中带有荧光团标记的 ddNTP。通过将识别的荧光团转换为携带该荧光团的已知 ddNTP 来确定最终的基因组序列。通过使用各种旨在组装这些序列并将其与参考序列进行比较的软件工具，可以简化此过程。当同一位置存在多个峰（或碱基）或确定的序列与参考序列不同时，即可识别变异（图 3）。桑格测序长期以来一直被认为是准确检测单核苷酸变异以及缺失和插入的黄金标准，只要包含在扩增的 PCR 产物中即可。然而，细胞学标本桑格测序的应用受到检测灵敏度的限制，肿瘤负荷要求约为 50%，以避免由于肿瘤异质性高而出现假阴性。然而，通过广泛采用先进的下一代测序方法，体细胞桑格测序的许多局限性已经减少。
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先回答你PCR 是什么吧，本文建议直接收藏哦~
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是现代分子生物学实验的基础之一。
PCR 技术是一种对特定的DNA 片段在体外进行快速扩增的方法，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA 合成，使得DNA的数量呈指数级增长，是基因组研究的有力工具。
这一技术具备简便、高效、快速、灵活和易于操作的特性，已经迅速地扩展到其他领域，例如临床诊断、微生物检测、法医物证鉴定和食品安全检测等，是目前分子生物学中应用最为广泛的一项技术。



图1：PCR 工作流程，注：RNA 需反转录为cDNA 后进入PCR 步骤。

PCR 实验的第一步是制备模板DNA，无论是基因组DNA/RNA、质粒DNA 还是PCR 产物，我们均需进行纯化步骤，确保模板DNA 质量，排除PCR 干扰物质，如蛋白质、多糖等，还要防止PCR 抑制剂的污染，如酚类、乙醇的残留。

• Tip 1：纯化后的DNA 建议使用TE 缓冲液进行保存，如近期不用，请分装后置于-20 °C 冰箱保存，RNA 需分装后置于-80 °C 超低温冰箱保存。
  

PCR 实验第二步为核心步骤，细分包括PCR 反应液预混、加入模板DNA/cDNA、运行PCR 程序。
将PCR 反应液中除模板DNA 外的试剂进行预混后，分装到各个PCR 管中，保证反应体系一致，在进行试剂预混时，建议使用混匀仪进行，不推荐移液器吹吸和手动弹振，商业化的Taq 酶中通常会包含50% 的甘油，防止反复冻融影响酶活，如不进行有效混匀，Taq 酶分布不均，严重影响PCR 结果。

• Tip 2：如需补水，请使用灭菌后的超纯水，建议不要重复使用，灭菌后请分装后冷冻保存。其他试剂如可能，建议均进行分装保存。如不使用热启动Taq 酶，操作时请将酶和预混液冰浴放置。
  

加入模板DNA/cDNA 前，亦需要将其进行充分混匀后加样，确保结果重复性。如需加入多个模板，请清晰标记，以免混淆，并在加完一个模板后立即盖严PCR 管盖，防止交叉污染。加入模板DNA 后，请混匀并瞬时离心。
运行PCR程序前，请确保PCR仪性能正常，且PCR耗材与PCR仪适配。热盖温度设置要高于模块温度，一般设定为105 °C，目的是防止PCR 反应液蒸发；PCR 程序的温度条件和时间，需要根据模板DNA 的特性、引物Tm 值和Taq 酶的特性进行设置，PCR 程序完成后建议在10 °C - 16 °C 保温，在确保无非特异性PCR 产物生成的同时延长PCR 仪使用寿命。在PCR 优化实验中，梯度温度功能能够帮助我们快速找到最佳反应条件。

• Tip 3：如所用仪器为Eppendorf 产品，建议激活TSP 功能（样品保护功能：当热盖升温时，加热模块20°C 保温），可降低非特异性产物的生成几率。
  

定性PCR 实验最后一步为产物分析，通常为琼脂糖凝胶电泳分析，还包括PCR-ELISA 分析、测序分析、杂交分析等。
从图1 中我们可以看出，PCR 实验的各个步骤均需使用移液器，建议每个步骤配备专用移液器，最好能够配合带滤芯吸头进行移液工作，有效防止气溶胶污染。
<hr/>了解更多PCR 知识原理，关注我们，后续将更新系列视频↓  
Eppendorf实验室

队长是我

PCR是分子生物学的核心技术，功能强大。可在体外高效快速地对不同来源的特定DNA或RNA序列进行酶扩增。标准的PCR反应由目标DNA、一组目标DNA序列旁侧的合成寡核苷酸引物、一种热稳定DNA聚合酶(通常是Taq聚合酶)以及核苷酸组成。在热循环仪中，每个扩增循环分三个阶段：首先，双链DNA(dsDNA)变性成为两个单链DNA；其次，引物退火与目标DNA序列结合；最后， DNA聚合酶从引物开始延伸DNA进而产生一条由一条新链和一条母链组成的新双链DNA。而循环中新产生的每条DNA链都会成为下一个循环中的模版，因此只需20个循环DNA就可以增加100万倍。据我所知，这个主题在www.sigmaaldrich.cn上有详细的介绍和解释
逆转录酶 PCR (RT-PCR)

RT-PCR，或称逆转录PCR，由标准PCR技术衍变而来，可对从极少样品中提取出的特定信使RNA进行扩增。免去了传统克隆技术中冗长的信使RNA提纯过程。在逆转录PCR中，除使用标准PCR反应物外，还可使用逆转录酶和RNA样品。其中逆转录酶在反应被加热到37摄氏度时可从RNA样品中合成一条互补配对的cDNA拷贝。然后，这条cDNA链与引物退火配对合成第一条链。之后按标准PCR的流程生成双链DNA。逆转录PCR经常与实时定量PCR（qPCR）结合，广泛应用于细胞及组织转录水平的定量分析。

清风寡欲

PCR实验室又称基因扩增实验室，PCR是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）的简称。它是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可视为特殊的DNA体外复制。通过DNA基因追踪系统，可以快速掌握患者体内的病毒含量，精度高达纳米级。

在COVID-19 流行之前，大多数PCR实验室都集中在大型三级甲等医院。由于建设成本高、人员素质要求高、实验室运行成本高、常规检测样本少，很多二级医院没有建设。 在国家政策和疫情发展的推动下，各地二级及以上医疗机构纷纷建立独立合规的PCR实验室。

新冠疫情终将结束。“遍地开花”的PCR实验室，除了新冠核酸检测，还能做什么？本文整理介绍了PCR实验室可以进行的检查项目。



Biological laboratory
一、感染性疾病分子检验项目
1.乙肝病毒核酸检测
2.乙肝病毒基因分型检测
3.丙肝病毒核酸检测
4.丙肝病毒基因分型
5.结核分枝杆菌DNA定量检测
6.EB病毒DNA定量检测
7.巨细胞病毒DNA定量检测
8.单纯疱疹病毒DNA定量检测
9.肺炎支/衣原体DNA定量检测
10.淋球菌核酸检测
11.沙眼衣原体核酸检测
12.解脲脲原体核酸检测
13.人乳头瘤病毒核酸检测
14.人类免疫缺陷病毒核酸定性检测
15.人类免疫缺陷病毒核酸定量检测
16.B族链球菌核酸检测
二、遗传性疾病分子检验项目
1.Y染色体微缺失检测
2.苯丙氨酸羟化酶基因突变检测
3.遗传性耳聋基因检测
4.遗传性药物性耳聋基因检测
5.地中海贫血基因检测
三、二代测序检验项目
1.BRCA基因突变检测
2.肺癌个性化基因检测
3.乳腺癌基因突变检测
4.BRAF-V600E基因突变检测
5.实体肿瘤相关基因检测
四、药物敏感性相关分子检验项目
1.结核分枝杆菌耐药基因多态性检测
2.万古霉素耐药基因检测

检验医师

聚合酶链式反应（PCR）是一种彻底改变了分子生物学世界及其他领域的技术。在这篇文章中，我们将讨论PCR的简要历史及其原理，强调PCR的不同类型及其应用的具体目的。
PCR原理和历史

1983年，美国生物化学家Kary Mullis在深夜开车回家时，突然有了灵感。他在一张收据的背面写下了最终使他在1993年获得诺贝尔化学奖的想法。这个概念很简单：在实验室的试管中复制在细胞中发生的DNA复制过程。其结果是一样的：在现有的基础上产生新的互补DNA（cDNA）链。
Mullis将Sanger的DNA测序的基础作为他的新技术的起点。他意识到，重复使用DNA聚合酶会引发连锁反应，导致特定DNA片段的扩增。
1976年，他发现了一种恒温DNA聚合酶，Taq，它是从温泉中发现的水热菌中分离出来的[1]。
在发现Taq聚合酶之前，分子生物学家已经在尝试优化循环DNA扩增方案，但他们需要在每个循环中添加新的聚合酶，因为这种酶不能承受DNA变性所需的高温。拥有一种热稳定的酶意味着他们可以多次重复扩增过程，而不需要在每个循环添加新鲜的聚合酶，使整个过程可以扩展，更有效率，更省时。
1985年，Science杂志首次描述了这种使用Taq聚合酶的聚合酶链反应（PCR）[2]。
1993年，第一个经FDA批准的PCR试剂盒投放市场。从那时起，PCR得到了稳步和系统的改进。它已经成为从法医证据分析和诊断，到疾病监测和基因工程的一个游戏规则的改变者。毫无疑问，它被认为是20世纪最重要的科学进步之一。
标准PCR实验概述

PCR用于从被称为模板DNA的起始材料复杂混合物中扩增出一个特定的DNA片段。样品制备和纯化方案取决于起始材料，包括样品基质和目标DNA的可及性。通常情况下，需要将DNA提纯到它的最小扩增浓度。然而，PCR确实需要了解待扩增DNA片段（称为目标DNA）侧面的DNA序列信息。
从实用的角度来看，PCR实验相对简单，可以在几个小时内完成。一般来说，一个PCR反应需要五个关键试剂：
待扩增DNA：也叫PCR模板或模板DNA。这种DNA可以是任何来源的，如基因组DNA（gDNA）、cDNA和质粒DNA。
DNA聚合酶：所有PCR反应都需要一种能在高温下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是常用的一种，它能在70℃下以60个碱基/秒的速度结合核苷酸，并能扩增长达5kb的模板，因此它适用于标准的PCR，没有特殊要求。新一代的聚合酶正在被设计来改善反应性能。例如，有些聚合酶被设计成只在高温下激活，以减少反应开始时的非特异性扩增。其他的聚合酶则具有“校对”功能，例如，在克隆过程中，扩增序列与模板序列完全一致时，这种功能是非常重要的。
引物：DNA聚合酶需要一个简短的核苷酸序列来指示它们需要启动扩增的位置。在PCR中，这些序列被称为引物，是单链DNA的短片段（大约15 ~ 30个碱基）。在设计PCR实验时，研究人员要确定要扩增的DNA区域，并设计一对引物，一个在正向链上，一个在反向链上，专门针对目标区域的侧翼。
引物设计是PCR实验的一个关键部分，应谨慎进行。引物序列的选择必须以感兴趣的独特DNA为目标，避免与类似序列结合的可能性。它们应该有相似的熔解温度，因为退火步骤对两条链来说是同时发生的。
引物的熔化温度可能受到鸟嘌呤（G）或胞嘧啶（C）与腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）相比所占百分比的影响，较高的GC含量会提高熔化温度。调整引物长度可以帮助在匹配引物对时补偿这一点。避免形成二级结构或引物二聚体的序列也很重要，因为这将降低PCR效率，有许多免费的在线工具可用于帮助设计引物。
脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTPs）：这些作为合成DNA新链的构件，包括四种基本的DNA核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。dNTPs通常以等摩尔量添加到PCR反应中，以实现最佳的碱基结合。
PCR缓冲液：PCR缓冲液确保在整个PCR反应中保持最佳条件。PCR缓冲液的主要成分包括氯化镁（MgCl2）、tris-HCl和氯化钾（KCl）。氯化镁作为DNA聚合酶的辅助因子，而tris-HCl和氯化钾在反应期间保持稳定的pH值。
PCR反应是通过将上述试剂加入到一个试管中，并将试管置于PCR仪中进行反应。
PCR扩增包括三组确定的时间和温度，称为步骤：变性、退火和延伸（图1）。


图1 | 一个PCR循环的步骤
这些步骤中的每一个都被称为循环，重复30 ~ 40次，每个循环的DNA数量翻倍，获得扩增（图2）。


图2 | 通过PCR进行DNA分子扩增的不同阶段和循环
让我们仔细看一下每个步骤。
变性

PCR的第一步，称为变性，将模板DNA加热到95℃，持续几秒钟，随着两条DNA链之间的氢键迅速断裂而分离。
退火

然后将反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50 ~ 65 ℃，然而，确切的最佳温度取决于引物的长度和序列，每套新的引物都必须仔细优化。
两条DNA链可以在这个温度下重新结合，但大多数不会，因为混合物中含有大量过量的引物，它们在特定的互补位置与模板DNA结合，或退火。一旦退火步骤完成，模板DNA和引物之间将形成氢键。这个时候，聚合酶已经准备好扩展DNA序列。
延伸

然后将温度提高到混合物中存在的DNA聚合酶理想工作温度，通常在72℃左右，如果是Taq，则为74℃。
DNA聚合酶附着在每个引物的一端，合成新的DNA链，与模板DNA互补。现在我们有四条DNA链，而不是一开始就有的两条。
温度回升到94℃，双链DNA分子，其中包括“原始”分子和新合成的分子，再次变性为单链。这就开始了变性-退火-延伸的第二个循环。在这第二个循环结束时，有8个单链DNA分子。通过重复30次循环，开始时存在的双链DNA分子被转化为超过1.3亿个新的双链分子，每个分子都是由两个引物的退火点划定起始分子区域的副本。
为了确定扩增是否成功，PCR产物可以通过凝胶电泳进行可视化，显示扩增子的存在/不存在、大小和大致丰度。根据应用和研究问题，这可能是一个实验的终点，例如，如果确定一个基因是否存在。否则，PCR产物可能只是更复杂的下游调查（如测序和克隆）的起点。
不同类型的PCR

由于其多功能性，PCR技术近年来不断发展，导致了几种不同类型的PCR技术的发展。
一些最广泛使用的是：
定量实时PCR（qPCR）

最有用的发展之一是定量实时PCR或qPCR。顾名思义，qPCR是一种定量技术，可以实时监测扩增过程并在扩增过程中检测PCR产物[2]。
它可以用来确定目标DNA的起始浓度，在许多情况下可以忽略凝胶电泳的需要。这要归功于加入了非特异性的荧光插层染料，如SYBR® Green，它与双链DNA结合后会发出荧光，或DNA寡核苷酸序列特异性的荧光探针，如水解（TaqMan）探针和分子信标。
探针与扩增子内的DNA目标序列特异性结合，并利用福斯特共振能量转移（FRET）的原理，通过一端的荧光分子和另一端的淬灭剂的耦合产生荧光。对于荧光染料和探针来说，随着目标DNA拷贝数的增加，荧光水平也按比例增加，从而可以参照含有已知拷贝数的标准对扩增进行实时定量（图3）。


图3 | qPCR扩增图和标准曲线示例，用于对未知样本的拷贝数进行量化。
qPCR使用配备有荧光检测系统的专用PCR仪，在扩增过程中监测荧光信号。
反转录-PCR （RT-PCR）

反转录（RT）-PCR和RT-qPCR是两种常用的PCR变体，能够在临床和研究环境中进行基因转录分析和病毒RNA的定量。
RT是用单链模板RNA制作cDNA的过程[3]，因此也被称为第一链cDNA合成。RT-PCR的第一步是在RNA模板和DNA寡核苷酸引物之间合成一个DNA/RNA杂交体。催化这一反应的逆转录酶具有RNase活性，然后降解杂交体的RNA部分。随后，通过逆转录酶的DNA聚合酶活性合成一个单链DNA分子。高纯度和高质量的起始RNA对于成功的RT-PCR是至关重要的。
RT-PCR可以按照两种方法进行：一步RT-PCR和两步RT-PCR。在第一种情况下，RT反应和PCR反应发生在同一试管中，而在两步RT-PCR中，这两个反应是分开的，并依次进行。
反转录-定量PCR（RT-qPCR）

上述反转录也经常作为qPCR的第一步，对生物样品中的RNA进行定量（无论是RNA转录本还是来自病毒RNA基因组）。
与RT-PCR一样，有两种通过RT-qPCR量化RNA的方法：一步RT-qPCR和两步RT-qPCR。在这两种情况下，RNA首先被逆转录成cDNA，作为qPCR扩增的模板。在两步法中，逆转录和qPCR扩增作为两个独立的实验依次进行。在一步法中，RT和qPCR在同一管中进行。
数字PCR（dPCR）和数字滴定PCR（ddPCR）

数字PCR（dPCR）是原始PCR方案的另一种修改版[4]。与qPCR一样，dPCR技术使用DNA聚合酶，利用引物组和探针从复杂的样品中扩增目标DNA。不过，主要的区别在于PCR反应的分区和最后的数据采集。
dPCR和ddPCR是基于限制性稀释的概念。PCR反应被分割成大量纳升体积的子反应（分区）。PCR扩增是在每个液滴内进行的。在PCR之后，用泊松统计学对每个液滴进行分析，以确定PCR阳性液滴在原始样品中的百分比。
一些分区可能包含一个或多个目标拷贝，而其他分区可能不包含目标序列。因此，分区分类为阳性（检测到目标）或阴性（未检测到目标），为数字输出格式提供基础。
ddPCR是最近的一项技术，在2011年开始使用[5]。ddPCR利用水油乳剂形成分隔模板DNA分子的分区。这些液滴基本上充当独立的试管，PCR反应就在其中进行。
微流控PCR

带有微通道和微室的微流控处理系统最近的发展为一系列的实际应用铺平了道路，包括在微流控芯片上通过PCR扩增DNA。
在芯片上进行的PCR得益于微流控技术在速度、灵敏度和试剂低消耗方面的优势。这些特点使微流控PCR对POCT特别有吸引力，例如，用于诊断应用。从实用的角度来看，样品流经一个微流控通道，反复通过反映PCR不同步骤的三个温度区。10 μL的样品进行20个PCR循环只需要90秒[6]。随后的分析可以很容易地在片外进行。
PCR故障排除

不同的PCR方法都有优点和缺点，对它们所适合的应用产生影响[7]。表1总结了这些优点。
表1 | 不同PCR方法的主要优点和缺点


PCR的应用

PCR已经成为现代分子生物学中不可缺少的工具，并完全改变了科学研究。该技术还为分子生物学领域以外的人打开了细胞和分子过程的研究，因此也被许多学科的科学家发现了用途。
虽然PCR本身是一种强大的独立技术，但它也被纳入了更广泛的技术，如克隆和测序，作为这些工作流程中一个小而重要的部分。
PCR的研究应用包括：
基因转录

PCR可以检查特定时间点上细胞类型、组织和生物体之间基因转录的变化。在这个过程中，RNA从感兴趣的样品中分离出来，并反转录成cDNA。然后，特定基因的原始RNA水平可以从PCR中扩增的cDNA数量中进行量化。
基因分型

PCR可以检测特定细胞或生物体的等位基因的序列变化。一个常见的例子是对转基因生物体进行基因分型，如基因敲除和基因敲入小鼠。在这种应用中，引物被设计用来扩增转基因部分（在转基因动物中）或突变部分（在突变动物中）。
克隆和诱变

PCR克隆是一种广泛使用的技术，通过PCR扩增的双链DNA片段被插入载体（如gDNA、cDNA、质粒DNA）。例如，这使得创建的细菌菌株的遗传物质被删除或插入。定点诱变也可用于通过克隆引入点突变。这通常采用一种被称为重组PCR的技术，其中重叠的引物被专门设计来纳入碱基替换（图4）。这种技术也可用于创造新的基因融合。


图4 | 描述重组PCR实例的图表
测序

PCR可用于富集测序用的模板DNA。推荐用于制备测序模板的PCR类型被称为高保真PCR，能够保持DNA序列的准确性。在Sanger测序中，PCR扩增的片段随后被纯化并在测序反应中运行。在第二代测序（NGS）中，PCR被用于文库制备阶段，通过PCR富集DNA样本以增加起始数量，并用测序适配体标记以实现多重检测。桥式PCR也是第二代NGS测序过程的一个重要部分。
无论是作为一种独立的技术还是作为其他方法的主力，PCR已经改变了一系列的学科。这些学科包括：
遗传研究

PCR在全球大多数实验室中使用。最常见的应用之一是基因转录分析[9]，目的是评估特定基因转录物的存在或丰度。它是通过克隆操纵生物体，动物、植物和微生物，的遗传序列的一种强大技术。这使得基因或部分基因可以被插入、删除或突变，以改变基因标记的表型，阐明基因的功能和开发疫苗，这只是其中的几个例子。
在基因分型中，PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列变化。它的用途也不限于人类。农业中的植物基因分型有助于植物育种者选择、完善和改进其育种品种。如上所述，PCR也是丰富测序样本的第一步。例如，人类基因组计划（HGP）中的大多数绘图技术都依赖于PCR。
医学和生物学研究

PCR被用于大量的医学应用，从疾病相关的基因突变的诊断测试，到传染病原体的鉴定。PCR在医学领域应用的另一个很好的例子是产前基因测试。通过PCR进行产前基因测试可以识别胎儿的染色体异常和基因突变，为准父母提供关于他们的婴儿是否有某些遗传疾病的重要信息。PCR也可以作为植入前遗传学诊断工具，用于筛选体外受精（IVF）程序的胚胎。
法医学

我们独特的基因指纹意味着PCR可以在亲子鉴定和法医调查中发挥重要作用，以确定样本的来源。例如，从犯罪现场分离出的少量DNA样本可以与DNA数据库或嫌疑人的DNA进行比较。这些程序确实改变了警方调查的方式。真实性测试也利用了PCR遗传标记，例如，确定肉的来源物种。分子考古学也利用PCR来扩增考古遗迹的DNA。
环境微生物学和食品安全

通过PCR检测病原体，不仅在病人的样本中，而且在食品或水等基质中，对诊断和预防传染病至关重要。
PCR是每个领域检测核酸的基准技术，从生物医学研究到法医应用，Kary Mullis将他的想法写在路边的一张收据背面，结果带来了一个革命性的技术。
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参考文献

• Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 1976;127(3):1550-57 doi: 10.1128/JB.127.3.1550-1557.1976
  
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