实验室技能：细胞换液/传代/铺板

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换液

• 提前打开37℃水浴锅，将培养基、PBS于水浴锅适当加热
  
• 将培养皿中旧的培养基倒掉吸尽，对着培养皿壁打入2-3ml 1×PBS溶液，轻晃使PBS流过细胞表面，倒掉吸尽，可根据实际情况清洗1-2遍
  
• 吸尽PBS，加入适当体积培养基，将细胞放入37℃、5%CO2培养箱
  

传代（1传2）

• 将培养皿中旧的培养基倒掉吸尽，对着培养皿壁打入2-3ml      1×PBS溶液，轻晃使PBS流过细胞表面，倒掉吸尽，可根据实际情况清洗1-2遍
  
• 吸尽PBS，加入1ml胰酶进行消化，待细胞从皿底部大片脱落（一般在1-5min内，不同细胞，消化时间大有不同），加入两倍胰酶体积的培养基终止消化
  
• 用1ml移液枪吸取皿中细胞培养基悬液不断吹打皿底，旋转培养皿吹打各个角落，待到皿底干净透亮即可，将细胞悬液吸入到15ml离心管，可根据需要考虑是否要用1-2ml培养基清洗培养皿获得残留细胞
  
• 使用离心机于1000rpm离心3-4min
  
• 倒出并吸出上层胰酶以及培养基，重新加入新的培养基2ml重悬
  
• 在2个培养皿中提前加入好5-6ml培养基，将离心管中的细胞悬液平均分配加入到2个培养皿中，将细胞放入37℃、5%CO2培养箱
  

铺板

• 将培养皿中旧的培养基倒掉吸尽，对着培养皿壁打入2-3ml      1×PBS溶液，轻晃使PBS流过细胞表面，倒掉吸尽，可根据实际情况清洗1-2遍
  
• 吸尽PBS，加入1ml胰酶进行消化，待细胞从皿底部大片脱落（一般在1-5min内，不同细胞，消化时间大有不同），加入两倍胰酶体积的培养基终止消化
  
• 用1ml移液枪吸取皿中细胞培养基悬液不断吹打皿底，旋转培养皿吹打各个角落，待到皿底干净透亮即可，将细胞悬液吸入到15ml离心管，可根据需要考虑是否要用1-2ml培养基清洗培养皿获得残留细胞
  
• 使用离心机于1000rpm离心3-4min
  
• 倒出并吸出上层胰酶以及培养基，重新加入新的培养基3-4ml重悬
  
• 取出1个1.5mlEP管，加入900μl培养基或者PBS（因PBS不容易起泡，当计数的细胞不回收时，可考虑加入PBS），将细胞重悬液吹打均匀，吸出100μl细胞悬液，加入到提前加有PBS的EP管中
  
• 准备一个细胞计数板，盖好盖玻片，将EP管细胞液体混合均匀，吸出10μl，将其打入到盖玻片和计数板中间
  
• 将细胞计数板于显微镜下计数，计算四角细胞总和x（每个角16个小格），则细胞悬液密度为2.5x万个细胞/ml
  
• 如铺设96孔板，每孔加入100μl细胞培养基，铺设1个96孔板需要10ml体积的细胞悬液；准备一个50ml离心管或适合体积的管，加入所需要细胞数的细胞悬液，用培养基补齐至10ml，拧紧瓶盖颠倒混匀
  
• 准备好96孔板，将10ml细胞悬液倒入无菌无酶加样槽，使用100μl排枪将其加入到96孔板中（加入过程中，随时用排枪吹打混匀，因为细胞会下沉，若不吹打会导致铺设细胞量不均匀），加完后不用摇匀，排枪加入过程中会均匀打入到孔底部，摇晃反而会导致细胞聚集在中心
  
• 其余细胞原悬液加入到培养皿中进行传代培养，将培养皿及孔板放入37℃、5%CO2培养箱
  

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