PCR技术操作过程中的注意事项？

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PCR技术操作过程中的注意事项？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/23470390

大力水手

不知如何有效设计引物？记住这五条PCR引物设计的一般原则：
1.引物长度：15-30bp,一般为20bp左右。
2.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。上下游引物的GC含量不能相差太大。A/T/C/G最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
3.引物结构：避免引物3’端出现互补序列及二级结构，3’端的碱基特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。
4.引物中酶切位点一般加在5’端，合适的酶切位点便于后续实验中的酶切分析或分子克隆。
5.引物浓度：每条引物浓度0.1-1umol或10-100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物间二聚体的形成机会。
很多同学初遇PCR时，原以为可以轻松搞定，谁知PCR却是一个不折不扣的大坑。各种假阳性、假阴性结果齐飞，非特异性扩增条带一如狗皮膏药一般挥之不去，在寻找各种原因无果后，真的很想把电泳胶捏碎……
在和同学们交流的过程中，我发现大家普遍遇到的问题有：

• 不知如何有效设计引物；
  
• PCR电泳无扩增条带；
  
• 扩增产物不符合要求；
  
• 条带总和你玩“捉迷藏”……
  

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猫大硕士毕业后曾在技术公司担任实验室主管，又经博士阶段系统科学训练，实验技能极为丰富全面。
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清风寡欲

自从COVID-19大流行病爆发以来，PCR就被大家挂在嘴边。然而，只有在实验室工作的人才知道，使用这种成熟的技术获得理想的结果是多么困难。出于这种挫折感，出现了一个流行的笑话，即PCR应该代表‘吸取、哭泣、重复’。为了确保从现在起这只是一个笑话，而且你的PCR反应再也不会让你感到绝望，我们已经汇编了成功的PCR设置的最重要的提示和技巧。
1、什么是PCR？

聚合酶链式反应（PCR）用于扩增特定的DNA序列供下游使用。其发明者Kary Mullis的PCR专利于1987年获得批准，六年后被授予诺贝尔化学奖[1]，从那时起，PCR一直是最基本的分子生物学技术之一。如果没有这项技术，遗传工程、基因分型、测序和家族关系的鉴定等等应用就不可能实现。
要进行PCR反应，你需要准备一个Master mix，加入DNA模板，并使用热循环器扩增感兴趣的序列。
2、PCR技巧和窍门

建立一个PCR反应看起来很简单，但事实远非如此。正确计算所需的Master mix试剂量，以获得正确的体积和正确的浓度，是第一个挑战。
一旦完成了这一点，就需要将试剂混合在一起。这里的困难是，液体通常必须被冷却，而且它们通常具有高度的粘性、粘性，需要的数量也很少。此外，工作必须集中进行，因为分心或中断会很快导致你不再知道哪些试剂已经被加入到Master mix中。在向PCR条或板中加入Master mix并加入DNA模板时，也很容易发生跳管或跳孔等错误，特别是在使用单道移液器时。


最后也可能是最大的挑战是保持你的PCR反应不受污染。PCR是一种非常敏感的检测方法，可以从极少量的起始材料中产生大量的核酸拷贝，所以扩增子和样品污染可能是一个巨大的问题。
2.1、Master mix的计算

让我们先来看看建立PCR Master mix所需的数学计算方法。我们假设你要建立几个PCR反应，每个反应的体积为50 μL。
为了计算每种试剂所需的体积，最好用必要的成分建立一个表格（见表1），并填写缓冲液、氯化镁、dNTPs和引物库存浓度和期望最终浓度。然后，用原液浓度除以最终浓度，计算出稀释系数。为了确定单个PCR反应所需的体积，用所需的反应体积除以稀释系数[2]。
对于聚合酶，需要一个稍微不同的方程式。酶的制造商会告诉你1 μL中聚合酶的量，例如，5单位/μL。在库存浓度一栏里填上这个值，然后把所需的量，例如1.25单位，在最终浓度栏中。然后可以计算出所需的体积，如下。1.25单位 ×（1 μL/5单位） = 0.25 μL[3]。
所需的DNA模板体积取决于你的样品类型。你应该加入大约1 pg到10 ng的质粒或病毒DNA，以及1 ng到1 µg的基因组DNA。在下面的例子中，我们计算了想要制备0.5 μL的1 μg/μL的DNA模板，你需要使用多少试剂[4]。
最后，加入所有试剂的所需体积。所需的总反应体积（50 μL）与所得到的结果之间的差额，就可以得到PCR级水的体积[5]。

表1 | PCR Master mix混合表的例子

在确定了一个PCR反应所需的试剂量后，你可以简单地将它们乘以你的样品数（加上阴性和阳性对照），得到整个PCR装置的总体积。我们建议在这个结果的基础上再加一个等分量，因为在移液过程中，由于蒸发、粘附在吸头上或移液不准确，一些混合液可能会丢失。
就这样，你现在可以按照下面列出的最佳移液方法来设置你的PCR反应了。
2.2、PCR移液最佳方法

首先从上面列出的所有成分开始准备你的Master mix，除了DNA模板。准备实验所需的全部Master mix，然后将单个等分量转移到PCR条或板中，其巨大的好处是你可以更准确地移液。
除此之外，它还减少了移液步骤，使整个过程不那么累人和容易出错。由于不能完全排除移液错误，你应该按照价格的顺序添加Master mix成分，从最实惠的试剂开始。这样，如果你不得不重新开始，你浪费的钱就少了[6]。
一旦你的Master mix混合完成，充分混合并分装到试管或平板中，你就可以加入DNA模板。由于DNA样品通常是高粘性的，而且需要少量的，你应该把它们分配到Master mix中或分配到试管或孔的壁上。分装后，保持柱塞下压，同时沿着实验器皿的壁轻轻拖动尖端，以去除任何残留的液体。此外，我们建议使用低保留的吸头。
如果你没有使用热启动聚合酶，请在制备Master mix和添加样品的整个过程中冷却你的试剂，以防止非特异性扩增。


当你准备将样品装入热循环仪时，检查样品是否盖紧或密封，并将其旋转，以确保扩增过程中没有液滴留在实验器皿壁上。
2.3、PCR反应的移液方案

在讨论各种移液方案之前，我们想谈谈液体处理的一个最重要的方面。无论你选择哪种移液器，都要确保它们得到良好的维护，定期校准并在两次使用之间检查其性能。
用于制备混合液的最实惠的移液器将是手动单通道型号。然而，由于你需要精确测量和混合几种非常昂贵的试剂，我们建议投资电子单道移液器。电机控制的活塞运动保证它们总是准确地分配出所需的体积，最大限度地减少变化，以提高移液的精度和准确性。
对于容器，你可以在试管中准备好Master mix，或者，如果你打算用电子多通道移液器转移，可以在一个低死体积的试剂库中准备。电子多道移液器和储液器的组合是这一步骤的理想选择，因为你可以同时填充几个试管或孔。除此之外，电子多道移液器通常具有重复分配模式，允许你吸出大量的混合液，然后将其分配到多个较小的等分中。如果你的产量不高，也可以使用电子单道移液器。
如果你的样品的实验室器皿格式与用于PCR扩增的容器不匹配，为了将DNA模板添加到Master mix等分中，可调节尖端间距的移液器会非常方便。例如，它可以让你在一个步骤中把几个DNA模板样品从微量离心管转移到96孔板的整行或整列。
高通量实验室甚至可能想利用自动解决方案来进行Master mix电镀和样品转移，如能够实现电子移液器自动化的移液平台。
2.4、如何防止PCR污染

应采取一些预防措施，以避免你的Master mix或DNA模板被以前PCR过程中产生的扩增子污染。


最有效的手段之一是将Master mix制备、DNA模板添加、扩增和分析区域相互物理隔离，并在层流或生物安全柜中工作。每个工作区及其相应的设备在实验前后都应该被清洁，在一个区域使用的工具不应该进入另一个区域。
当涉及到消耗品时，确保你购买的无菌产品经认证不含DNase、RNase和PCR抑制剂。移液器吸头应与移液器形成完美的密封，以消除吸头滴落或脱落时可能发生的污染。使用过滤吸头也将避免气溶胶进入你的移液器并污染后续的PCR反应的风险。
由于你也是一个潜在的污染源，所以一定要戴上手套，以防止将酶、微生物和皮肤细胞引入反应中，并在从一个区域到另一个区域时更换手套。除此之外，在整个PCR设置过程中，尽可能保持试管的封闭。
尽管有这些预防措施，你还是不能完全消除PCR反应被污染的可能性。为了避免在发生这种情况时不得不扔掉你的某种试剂的全部存货，你可以准备一次性使用的混合液成分的等份。你也可以提前准备好阳性和阴性对照的等分试样，以及定量PCR（qPCR）检测的标准品的连续稀释液。具有重复分配和连续稀释模式的电子移液器对这项任务很有帮助，不仅可以减少污染的风险，还可以提高PCR设置的效率。
3、总结

PCR是研究、诊断和法医方面的一项基本技术。它经常涉及到移取具有棘手特性的微不足道的试剂，因此可能很难获得理想的结果。此外，污染会对结果产生巨大影响，因为它是一种非常敏感的检测方法。我们希望本文提供的技巧和窍门能帮助你使你未来的PCR反应获得成功。其中许多建议也可以应用于其他扩增试验，如反转录和qPCR、循环介导的等温扩增（LAMP）和依赖螺旋酶的扩增（HDA）。
诊断科学编辑团队收集、整理和编撰，如需更多资讯，请关注公众号诊断科学（DiagnosticsScience）。
参考文献

• Cheriyedath, S. （2018）. History of Polymerase Chain Reaction （PCR）. https://www.news-medical.net/life-sciences/History-of-Polymerase-Chain-Reaction-（PCR）.aspx
  
• Seeding Labs （2019）. How To: PCR Calculations. https://www.youtube.com/watch?v=CnQV5_CEvAo
  
• McCauley, B. （2020）. Setting Up PCR Reactions. https://brianmccauley.net/bio-6b/6b-lab/polymerase-chain-reaction/pcr-setup
  
• New England Biolabs （n.d.）. Guidelines for PCR Optimization with Taq DNA Polymerase. https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-taq-dna-polymerase
  
• Lorenz, T. C. （2012）. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments, 63, e3998. https://doi.org/10.3791/3998
  
• Gold Biotechnology （2020）. How To: PCR Master Mixes. https://www.youtube.com/watch?v=LSfvCJ9gUQU
  

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https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=Mzg2NzUyNTgyNw==&mid=2247503365&idx=8&sn=61eaec6b135486a214417ff5e24e16b1&chksm=ceb8bba9f9cf32bf08b3be685592c0e630e4c66a28734da7ac3cbe78ce0ee5364b68fea13583&token=538840795&lang=zh_CN#rd

卡卡

实验前期准备

前期准备主要是提取、反转录和引物设计部分。
1.  RNA 提取注意事项
首先了解一下，RNA 抽提原则：保证 RNA 的一级结构、无其它物质的污染、得率高、覆盖所有转录本。再比较一下 Trizol 提取和试剂盒提取，Trizol 提取相对来说耗时长、含有害化学物质、纯度低、RNA 完整度不高；而试剂盒提取的优点是效率高、纯度高、完整度高，各位可根据实际科研情况选择操作方法。
RNA 提取注意事项：
① 使用无 RNase 的塑料制品和枪头，玻璃器皿要消毒，避免交叉污染；使用性能较好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；
② DEPC 有剧毒，小心配制；配制溶液应使用无 RNase 的水；
③ 操作人员应戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套；
④ 样品应避免反复冻融，否则影响提取 RNA 提取得率和质量；
⑤ 若下游实验对 DNA 非常敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 对 RNA 进行处理。
2.  反转录注意事项
秉承避免 RNA 被污染和降解的原则，按照产品说明书进行即可，本文对反转录过程的引物设计和注意事项给出了较明确的提示。
3. qPCR 引物设计注意事项
qPCR 过程中需要使用基因特异性引物扩增，从而分析目的基因表达量。
① 推荐使用软件 Primer Premier 5.0；
② qPCR 过程中使用引物长度推荐 25bp ，扩增产物长度 150bp ，可在 100bp-300bp 之间；
③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超过2℃，Tm 值在 60℃-65℃ 之间为佳；
④ 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC 含量控制在50%左右，3’端最后一个碱基最好为 G 或 C；
⑤ 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列；
⑥ 引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补；
⑦ 引物设计完成后需进行扩增效率检测，将扩增效率相同的引物用于定量比较分析。
4.  实验方法的选择
两步法：退火与延伸相同温度，最高可以达到72℃（很少采用），常用60℃，此温度下扩增引物二聚体和错配等扩增干扰较少，特异性高；每个循环时间较短，节约时间成本。
三步法：适合需要较高退火温度的引物，获得相对严谨的数据。
前期准备完毕，我们就可以进行接下来的实验了，为了避免踩到坑里，请仔细阅读！

实验中期操作

中期操作主要分为试剂的存储、模板制备、体系配制、实验程序设置和内参选择几个部分，具体内容如下：
1.  试剂储存
-20℃ 避光长期储存，避免反复冻融，使用前充分混匀，但要避免产生气泡。部分试剂解冻后可能出现絮状物质，4℃ 放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
2.  模板的制备
通常 1µg RNA 的反转录产物需要稀释10倍左右，以减轻 RNA 对 PCR 扩增的抑制。梯度稀释时，Ct 值落在15-28范围的稀释倍数作为原始模板稀释度，在此基础上进行5-10倍稀释。模板为 cDNA 原液时，上样量不超过 qPCR 反应总体积的1/10。
3.  体系配制
① 请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头，避免交叉污染和气溶胶污染。
② 推荐 10μL（q225、NOVO Max100）、20μL、50μL 体系；将引物和 qPCR Mix  混合配成大体系，混合均匀，为避免误差，可多配制1-2个加样孔的量，保证体系稳定性。
③ 通常引物终浓度为 0.2μM，也可以根据情况在 0.1-1.0μM 之间进行调整。
4.  实验程序设置
① 预变性推荐时间5min，根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。此外，根据不同的厂家的产品可以有对应的预变性时间。
② 退火温度根据引物和目的基因的长度适当调整。
③ 仪器需定期校准，此处整理不同 ROX 适用机型，给各位小伙伴参考。
表1  不同荧光染料对应机型


5.  内参的选择
内参基因通常指各种管家基因，各类管家基因在生物体各类细胞中都表达。理想的内参基因可在各类细胞或组织、各种试验条件下恒定表达。但是不同物种、不同组织的管家基因表达存在特异性，目前还未发现完全理想的内参。下表是已报道的部分物种的 qPCR 内参基因，仅供参考。
表2  已报道部分物种的 qPCR 内参基


6.  如何筛选内参基因？
首先可以选择多个内参基因作为校正标准，再者可以使用 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper 比较内参基因表达的稳定性，使用软件 GeNorm、基因芯片数据和 EST 数据库筛选内参基因。
最后，只有更多的练习才能更好的克服问题，基本的操作部分以及注意事项就这么多了，能不能做好就看你自己了。

大力水手

PCR扩增注意事项其实很多，而且都不能忽略，尤其是要保证扩增特异性（可以使用
热启动PCR酶扩增），等到实验做多了，就不言而喻了