定性、定量、定位，WB、ELISA、IHC 三大免疫学实验，这一篇全搞定！

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免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段，用途非常广泛，既可用于基础理论和应用研究，因此免疫学研究一直都是生命科学领域学术前沿，发表的文章也几乎都是Cell、Natrue、Science及其子刊宠儿。
免疫印迹（WB）、免疫组化（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA），是免疫学三大常用工具，应用于目的蛋白的定位、定性和定量。
有了这篇纯干货，相信大家就能轻松搞定免疫学三巨头实验的各种疑难杂症！


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一、免疫印迹WB（Western blot）

偏向于定性和半定量

WB，是Western blotting的缩写，即蛋白质印迹法，又称免疫印迹（immunoblotting）,也就通过电泳技术分离不同组分，再采用印迹技术将蛋白质转移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗体的特异性结合原理，用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法，这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等方面。

WB基本原理：通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng（最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。


WB实验流程
先要进行 SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。


常见问题
1.高背景


2.信号弱或无信号


3.非特异性条带


4.弥散型条带



12个高频异常结果（带图分析）
1.无背景无条带

上图展示一点信号都没有，大部分情况是因为抗体加错了。如果中间出现细微的条带，可能是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL 发光液失效。

2.高背景

高背景是 WB 实验中最常见的问题，目的条带单一清晰，但其他地方又弥漫性较均一的背景（比较连续的）。杂带多大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。

<hr/>3 .非特异性条带

此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然也有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

4.条带中出现边缘规则的白圈

我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不宜太多或太少，建议高度与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住 NC 膜的两侧中间，使膜成 U 型，然后将 U 型底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，最后盖上海绵。

5.出现黑点和黑斑

牛奶溶解后，最好静止一下，然后轻轻吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。

6.条带拖尾

这种情况一般出现在大分子量抗体实验中，是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议 5min*5 次，不要担心洗这么多次把抗体和蛋白洗掉了，真正的抗原抗体相结合通过这种方式是洗不掉的。

7.出现非均一性背景

封闭时洗一抗洗二抗，以及发光时都应时刻注意切记蛋白面风干，一旦风干很可能会导致这个结果。

8.某个条带变形

很多实验室中使用的不是最新设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris 缓冲液要注意不要有杂质。

9.条带不均一

出现哑铃最大的可能是胶没有配好，胶凝固后不均一。如果你拔完梳子后出现上图中下面部分的情况，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。

10.最边缘条带弯曲

一般我们使用的是 10 孔的胶，如果你上样刚好 10 个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一

11.条带笑脸，marker正常

准备样本主要确认上样缓冲液是否为近期配置，并且要妥善保存，否则就会浪费珍贵的实验样本。一般电泳过程中恒压电泳，浓缩胶 80V，分离胶 120V，整个过程差不多需 2 个小时左右。

12.曝光结果条带扭曲

对于大分子量的抗体，跑胶前可以先把样本煮一下，然后稍微离心一下，同样也可以改善这种情况。

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二、酶联免疫吸附试验（ELISA）

可以定性也可以定量

用到了免疫学原理和化学反应显色，需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是 「吸附」的含义。
目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法ELISA。
在测定蛋白质等大分子时常用双抗夹心ELISA方法，在敏感性基因特异性上有明显的优势。


ELISA实验流程


ELISA注意事项
1.样本收集
每个标本量收集体积＝100 μL×检测种类，如要做复孔，标本量收集体积＝100 μL×检测种类×2。对收集后当天进行检测的标本，储存在 4 ℃ 备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 条件下保存，避免反复冻融。标本 2~8 ℃ 可保存 48 小时，-20 ℃ 可保存1个月。-70 ℃ 可保存 6 个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。如需离心的样本，离心转速不宜过高（2,000-3,000）
2.样品、标准品、质控品稀释
加完样本稀释液溶解标准品后应混匀放置室温 10~15 min 后再开始梯度稀释标准品
3.样品捕获抗体孵育
37 ℃ 恒温孵育，避免温度变化过大
4.生物素标记的抗体加入及孵育
生物素标记的抗体需用抗体稀释液按 1:100 配制，在加入 96 孔板前 2 小时内准备，37 ℃ 恒温孵育，避免温度变化过大
5.洗涤
机洗：将 25X 洗涤缓冲液稀释成 1X，1X 洗涤缓冲液洗三次，每次加 300 μL 浸泡 60 s 手洗：手洗次数应比机洗次数多，浸泡时间也应适当延长*手洗容易导致吸附在酶标板底部的试剂脱落，从而导致结果偏小，手洗次数过多也会影响实验结果，建议机洗
6.亲和素过氧化物酶（ABC）加入及孵育
ABC 在加入酶标板前 1 个小时内用 ABC 稀释液按 1:100 配制，使用前应放至室温平衡 30 min
7.底物显色（TMB 显色）孵育
TMB 在使用前应放置室温平衡 30 min，加的量为 90 μL
8.终止液终止反应
加完 TMB 终止液应让其混匀再在酶标仪上读数
9.酶标仪读数
在 450 nm 波长处测定 O.D 值
10.根据 O.D 值计算样本浓度
使用 CurveExpert 软件拟合标准曲线，根据标准曲线的拟合度（r 或 R2）以及残差平方和（s）选择合适的曲线

ELISA常见问题
1.ELISA 试剂盒可以检测哪些类型的标本？
我们的大多数 ELISA 试剂盒均适用于血清，血浆，细胞培养上清液和其它体液。在产品说明书和我们的目录上您会看到具体的适用范围。
2.样本为什么需要稀释？
1）在一些测试中，样本的读数高于标准曲线，为了得到更加准确的结果，需使分析物的含量在测定范围内，因此需要稀释；2）以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。
3.背景色过高主要有哪些原因？


4.梯度稀释时出现跳孔现象主要有哪些原因？



ELISA 其它常见问题解析










<hr/>三、免疫组化（IHC）

偏向于定位

融合了免疫学原理 (抗原抗体特异性结合) 和组织学技术 (组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等)，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色，来对组织 (细胞) 内抗原进行定位、定性及定量的研究 (主要是定位)。
IHC实验流程


IHC注意事项
1.组织取材
为避免蛋白丢失及组织受损引起的非特异试剂吸附，取材须快速（组织块也不宜太大）且要尽量避免人为损伤。
2.固定
固定要及时、彻底，但也不能固定过久。实验证明甲醛固定时间越久的组织越容易出现自发荧光及非特异性染色。一般以 12~36 小时最好。
3.石蜡片与冰冻片的选择
石蜡片制作对设备要求较冰冻片低，组织结构更好，保存条件简单时间也久。但对部分蛋白有较强烈的破坏作用，对蛋白保护较冰冻片差。冰冻片对蛋白的保护较石蜡片好，制作起来也较快。
4.灭活
过氧化物酶（HRP）系统的一定要做内源性过氧化物酶的灭活，而对于碱性磷酸酶（AP）系统和免疫荧光这个步骤不需要做。
5.抗原修复
不同的样本、不同的蛋白其最佳的抗原修复方式会有所区别，热修复（酸性修复液（柠檬酸盐修复液）、碱性修复液（EDTA 修复液））及酶修复（蛋白酶）都可做尝试。对于陈旧的样本要增加修复强度，比如延长修复时间。
6.封闭
常用的封闭液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封闭液。血清应选择与二抗同源的血清。
7.抗体孵育
一抗一定要与实验及样本匹配的，孵育条件以 4 ℃ 过夜最佳。二抗应匹配一抗， 37 ℃ 孵育半小时即可。
8.显色
DAB 显色建议在镜下控制反应时间，在阳性及背景之间选择平衡点。
9.结果观察
建议在数据库中查询准确的表达部位，比如
https://www.uniprot.org/
https://www.proteinatlas.org/

IHC常见问题
1.无染色


2.高背景


3.非特异性染色



13个高频异常结果（带图分析）
1、标本的固定
常见问题：
组织固定不及时或不完全固定，HE染色细胞核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失。
案例示范1


案例示范2


解决建议：
① 组织离体后尽快固定，组织块大小为15×15×5mm，切开固定效果好；
② 固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳；
③ 固定时间在4h-48h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果；
④ 固定液的量要超过组织体积5倍以上。

2、标本的取材，脱水，浸蜡
常见问题：
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片。
解决建议：
① 梯度酒精脱水尽量彻底充分；
② 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆；
③ 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。

3、标本的切片，捞片，烤片
常见问题：
切片太厚，有刀痕，有褶皱，脱片。
案例示范1


案例示范2


解决建议：
① 切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等需要比较薄（不超过3um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），常规都要6-8um最佳，冰冻可切至10um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4um均可,太厚易掉片，细胞重叠，影响观察。切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。
② 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在40℃左右。
③ 粘片时需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油调配而成，比例为1：1。 先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干。或者玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。
④ 烘干温度为50℃，时间为12～24h。

4.标本的脱蜡不完全
常见问题：
脱蜡不全,组织出现异染现象,异染现象一般是苏木素着色不佳,HE染色没有选择性,染色不均匀。有的是伊红染不上。
解决建议：
根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。

5.抗原修复
抗原修复是免疫组化中不可忽略的关键步骤。原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，是抗原与抗体结合点减少，从而令抗原抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。这种交联在高温加热或是蛋白酶水解作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。
常见问题：
阳性检测率及着色强度相对减弱。
案例示范


经验分享：
① 抗原修复缓冲液有多种，常用的则为柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），EDTA缓冲液（pH8.0-9.0），Tris/Tris-EDTA缓冲液（pH9.0-10.0），或者胰酶法（pH3.5±0.2）；
② 修复液的不同PH值对染色结果的影响比较大；
③ 没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原；
④ 大部分抗原在修复液pH8.0-9.0的范围值可以获得一个普遍较好的修复效果，所以碱性缓冲液应用普遍些。

6.封闭
常见问题：
① 封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性。
② 封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。
案例示范：


解决建议：
① 根据实验实际情况选择合适的封闭试剂和封闭时间。
② 根据二抗系统中是否含有生物素而选择封闭剂。
③ 无生物素的二抗系统可以不使用封闭剂，如Immunoway的RS0011通用型二抗。
④ 卵白素类的二抗系统需要根据生物素的种类选择相应的封闭剂在一抗前处理组织切片。
⑤ 封闭血清一般是和二抗同一来源，可封闭非特异性结合位点，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗的来源一致。

7、洗涤
案例示范


解决建议：
进行充分洗涤。

8.干片
案例示范


解决建议：
加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。

9.边缘效应
案例示范


解决建议：
组织切片与玻片黏贴牢固，试剂完全覆盖组织防止干片，加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止边缘效应。

10.一抗的选择
免疫组化耗时长，步骤繁多，为了得到特异性染色，获得可靠结论，选择合适的一抗十分关键。基本原则是选择选择特异性强，灵敏度高，背景低的抗体，结果稳定、重复再现性良好的抗体。
①抗体特异性
常见问题：
抗体特异性差，定位不准确。
案例示范1




解决建议：
抗体的特异性是选择抗体最重要的原则，不同抗体特异性不同，组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性需都准确。
②抗体的染色强度
常见问题：
检测结果会出现弱阳性。




解决建议：
适当调整抗体稀释比，或者选择染色强度高，高亲和力的抗体。
③抗体稀释比的影响
常见问题：
染色结果出现非特异性染色或者是低背景。
案例示范




解决建议：
当结果出现非特异性染色或者有背景时，可以适当调整一抗的稀释比例进行改善，特异性强的抗体检测结果不易受稀释比例的影响。
④一抗孵育条件
常见问题：
孵育条件对染色结果有影响。
案例示范


解决建议：
孵育条件对染色结果略有影响，需筛选合适的孵育条件。

11.不同组织的影响
常见问题
染色结果与预期不符，检测阴性或者弱阳性。
案例示范


解决建议
设置阳性组织切片的对照，因为同一蛋白在不同组织中的表达会有很大的差异。

12.二抗的选择
常见问题
使用不同的二抗显色系统会出现不同的结果，可能会有弱阳性结果。
案例示范


解决建议：
使用多聚物酶标记二抗比普通的HRP直标二抗灵敏度更高，背景更干净，对比更明显。

13.DAB显色
1）DAB絮状或团状沉积
常见问题
产生深棕至黑色的DAB絮状或团状沉积于组织切片上。
案例示范


解决建议：
① 现配现用：因为DAB显色液配置好了之后极容易产生DAB的沉积，从而导致样本上会出现深棕色的絮状沉淀，干扰结果的判定。
② 显色时间：所有说明书上的显色时间均为一个范围，有的反应迅速的30s-3min，有的反应缓慢的3-20min，应该灵活调整，最好是滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
③ 显示时间技巧：可选择一张阳性的片子，用计时器精确计时在显微镜下判断出具体时间后，再对所有片子进行显色，采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜，操作无误，10分钟内肯定能够显色，如果超过该时间，说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短，则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。
2）信号偏弱
常见问题
信号偏弱。
案例示范


解决建议：
适当延长显色时间，滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。

苏木素使用原则
① 不同的苏木素配方的染色时间各有不同，配置的新旧程度染色时间也不同。
② 国际上常用的为Harris苏木素，因为配方中含汞，通常还需要进行分化，返蓝的步骤，但颜色亮丽。
③ 改良的Mayer苏木素配方不需要分化，时间可以根据配置的时间调整染色时间15s-2min。

免疫组化的结果分析
①对照组必设。如阴性、阳性及自身对照。
从以下表中可知，只有6、7实验结果有意义。
1-5均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因ICH技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，则必须重复实验或换用抗体。


②阳性着色细胞计数法。在 40 倍光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组 3-6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
③灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
④分级法。免疫组化的半定量一般分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。





免疫组化实验6个小tips分享
① 选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。
② 试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。
③ 实验前提前清点实验的必需品是否齐全，做好问题与补救的计划方案。
④ 当抗体不够用的情况下，原先买的抗体最好不要用完，留做可能需要的验证试验。新的抗体要尽量同公司，同批号。
⑤ 温度过低时，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，或者可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样效果会更好；若温度适宜，那还是在室温下脱蜡，要不可能会适得其反。时间也是适情况而定。
⑥ 抗体反复冻融对导致效价降低；同时抗体要防止污染，不可用塑料保存，塑料可吸附抗体。

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