有没有大佬指导一下PCR及其原理？

莺歌燕舞

没有系统的学过这块 所以知道的七七八八 自己学不懂啊太笨了..

原文地址：https://www.zhihu.com/question/452334674

检验医师

聚合酶链式反应（PCR），即DNA扩增法，是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。这种技术最早是在1983年被美国的Mullis提出，并于1985年被发明。PCR技术从发明至今已有35年历史，技术发展相对成熟。
PCR技术发展至今已至第三代，经历了定性PCR技术、定量PCR技术（qPCR）与数字PCR技术（dPCR）三个阶段。不同阶段的PCR技术的特点、应用情况与行业发展情况也不尽相同。



图1.数字PCR发展

数字PCR（Digital PCR，dPCR）是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。dPCR检测过程主要包括样品的分散、PCR扩增、荧光信号采集与数据分析。试验结果通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式计算出DNA模板分子的起始浓度，从而实现绝对定量。




图2.数字PCR操作流程

在介绍数字PCR之前，首先和大家回顾一下荧光定量PCR技术（real time PCR, qPCR）。荧光定量PCR在操作流程上包括：a.核酸分子提取；b.RNA逆转录；c.荧光定量PCR检测这三步骤。在检测原理上荧光定量PCR主要包括两种方法：a.染料法（SYBRGreen或Eva Green）；b.Taqman探针法。
数字PCR（digital PCR，dPCR）
数字PCR技术，是一种荧光定量PCR技术的升级技术。依然是利用染料法或Taqman探针法进行的荧光检测，不同的是dPCR是终点检测荧光信号，qPCR是实时检测荧光信号。而数字PCR之所以是荧光定量的升级技术，主要是利用单分子扩增实现核酸的绝对定量。数字PCR将单个DNA分子置于独立的反应室中，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan探针法或染料法检测特定的靶序列。
数字PCR检测主要包括三步：第一，通过特定技术将PCR反应混合液分散到几万个反应单元（反应室）；第二，单分子在反应室中扩增；第三，PCR结束后检测荧光信号，最后通过泊松分布统计数数，计算出样本的拷贝数，实现核酸分子的绝对定量。与qPCR相比dPCR的绝对定量不需要利用标准曲线实现定量，而是直接可以通过单分子扩增结合泊松分布统计，既可实现绝对定量。
因此，数字PCR与荧光定量PCR不同点，主要体现在数字PCR需要进行分区后扩增，而荧光定量PCR是不需要分区扩增，而这种分区即可实现核酸分子的单分子扩增，单分子扩增既可以提高扩增效率，同时可以提高荧光检测的灵敏性和数据的可重复性。
dPCR与qPCR比较
实时荧光定量PCR可以进行相对定量，利用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量，标准品可选择纯化的质粒DNA或体外合成的ssDNA等，qPCR的定量是相对标准品的定量，是一种相对定量技术。
数字PCR 是基于传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的第3代PCR技术，它不需要标准品，也不要制作标准曲线，即能实现更灵敏、更准确的绝对定量。同时，数字PCR是单分子扩增技术，能够有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增加，反应受到抑制剂的影响就越小。



表1.dPCR与qPCR比较

数字PCR分区方法
数字PCR的主要核心点在于将PCR反应液分区至数万微反应单元，实现单分子扩增。不同厂家利用不同方法实现核酸分子的分区，目前数字PCR分区方法主要包括2种：微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)和芯片数字PCR(Chip digital PCR，cdPCR)。分别通过微液滴和微流体芯片实现分液，分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应。
1）ddPCR技术，利用油包水微滴生成技术。2）cdPCR利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上。
数字PCR技术应用
数字PCR具有明显的优势，已经广泛应用于核酸检测的方方面面。肿瘤液态活检，遗传生殖检测，公共卫生检测，环境微生物检测，RNA表达检测，NGS文库定量，甲基化检测的等。后期将推出数字PCR具体的应用，欢迎大家持续关注。也希望大家了解数字PCR后，能够帮助大家更好地解决目前面临的困难。

队长是我

PCR是分子生物学的核心技术，功能强大。可在体外高效快速地对不同来源的特定DNA或RNA序列进行酶扩增。标准的PCR反应由目标DNA、一组目标DNA序列旁侧的合成寡核苷酸引物、一种热稳定DNA聚合酶(通常是Taq聚合酶)以及核苷酸组成。在热循环仪中，每个扩增循环分三个阶段：首先，双链DNA(dsDNA)变性成为两个单链DNA；其次，引物退火与目标DNA序列结合；最后， DNA聚合酶从引物开始延伸DNA进而产生一条由一条新链和一条母链组成的新双链DNA。而循环中新产生的每条DNA链都会成为下一个循环中的模版，因此只需20个循环DNA就可以增加100万倍。 如果感兴趣可以到默克www.sigmaaldrich.cn看具体内容
逆转录酶 PCR (RT-PCR)

RT-PCR，或称逆转录PCR，由标准PCR技术衍变而来，可对从极少样品中提取出的特定信使RNA进行扩增。免去了传统克隆技术中冗长的信使RNA提纯过程。在逆转录PCR中，除使用标准PCR反应物外，还可使用逆转录酶和RNA样品。其中逆转录酶在反应被加热到37摄氏度时可从RNA样品中合成一条互补配对的cDNA拷贝。然后，这条cDNA链与引物退火配对合成第一条链。之后按标准PCR的流程生成双链DNA。逆转录PCR经常与实时定量PCR（qPCR）结合，广泛应用于细胞及组织转录水平的定量分析。
热启动PCR

热启动PCR技术用于在热激活执行前抑制反应中热启动Taq聚合酶活性或阻止经修饰脱氧核糖核酸的聚合。控制热启动聚合酶的活性的方法多样，包括化学修饰、抗体介导及适配体介导。
利用终点PCR对较长目标准确扩增


终点PCR通常在反应完成后用于探测目标是否存在及其相对丰度。由于附加了具备“校正”功能的元素，标准PCR能合成序列的长度最高为5000个碱基对。而兼具长度及准确度 （LA）的PCR结合第二种具有3’ 5’ 外切酶功能的热稳定聚合酶可修复末端核苷酸错参，所以不仅能够扩增长达40000个碱基对的DNA目标链，还极大地提高了其准确性。

感恩由您

还是搞不懂PCR 的原理？看过来，下面让你一分钟学会PCR 技术原理及实验工作流程。
PCR 技术原理类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，通过变性- 退火- 延伸三个基本步骤完成：
变性步骤使得模板DNA 双链或者PCR 扩增形成的双链DNA解离，成为单链，变性温度一般在93 °C 以上；退火步骤使得单链DNA 模板与序列互补的引物配对复性，退火温度与引物的Tm 值相关；延伸步骤使得DNA 模板- 引物结合物在72 °C、DNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为底物，靶序列为模板，按照碱基互补配对和半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 互补的半保留复制链。
重复循环以上三个步骤就可以获得更多的半保留复制链，而新链又可成为下次循环的模板，即扩增产物呈现指数增长，直至反应体系中的某个组分变为限制因素为止，产物不再按照几何方式积累，逐步进入PCR 反应平台期。



图1：PCR 指数扩增理论



图2：PCR 虚拟扩增曲线(Eppendorf 2012)



图3：典型PCR 程序 http://www.baike.com/wiki/PCR

PCR 工作流程




图4：PCR 工作流程，注：RNA 需反转录为cDNA 后进入PCR 步骤。

PCR 实验的第一步是制备模板DNA，无论是基因组DNA/RNA、质粒DNA 还是PCR 产物，我们均需进行纯化步骤，确保模板DNA 质量，排除PCR 干扰物质，如蛋白质、多糖等，还要防止PCR 抑制剂的污染，如酚类、乙醇的残留。

• Tip 1：纯化后的DNA 建议使用TE 缓冲液进行保存，如近期不用，请分装后置于-20 °C 冰箱保存，RNA 需分装后置于-80 °C 超低温冰箱保存。
  

PCR 实验第二步为核心步骤，细分包括PCR 反应液预混、加入模板DNA/cDNA、运行PCR 程序。
将PCR 反应液中除模板DNA 外的试剂进行预混后，分装到各个PCR 管中，保证反应体系一致，在进行试剂预混时，建议使用混匀仪进行，不推荐移液器吹吸和手动弹振，商业化的Taq 酶中通常会包含50% 的甘油，防止反复冻融影响酶活，如不进行有效混匀，Taq 酶分布不均，严重影响PCR 结果。

• Tip 2：如需补水，请使用灭菌后的超纯水，建议不要重复使用，灭菌后请分装后冷冻保存。其他试剂如可能，建议均进行分装保存。如不使用热启动Taq 酶，操作时请将酶和预混液冰浴放置。
  

加入模板DNA/cDNA 前，亦需要将其进行充分混匀后加样，确保结果重复性。如需加入多个模板，请清晰标记，以免混淆，并在加完一个模板后立即盖严PCR 管盖，防止交叉污染。加入模板DNA 后，请混匀并瞬时离心。
运行PCR程序前，请确保PCR仪性能正常，且PCR耗材与PCR仪适配。热盖温度设置要高于模块温度，一般设定为105 °C，目的是防止PCR 反应液蒸发；PCR 程序的温度条件和时间，需要根据模板DNA 的特性、引物Tm 值和Taq 酶的特性进行设置，PCR 程序完成后建议在10 °C - 16 °C 保温，在确保无非特异性PCR 产物生成的同时延长PCR 仪使用寿命。在PCR 优化实验中，梯度温度功能能够帮助我们快速找到最佳反应条件。

• Tip 3：如所用仪器为Eppendorf 产品，建议激活TSP 功能（样品保护功能：当热盖升温时，加热模块20°C 保温），可降低非特异性产物的生成几率。
  

定性PCR 实验最后一步为产物分析，通常为琼脂糖凝胶电泳分析，还包括PCR-ELISA 分析、测序分析、杂交分析等。
从图4 中我们可以看出，PCR 实验的各个步骤均需使用移液器，建议每个步骤配备专用移液器，最好能够配合带滤芯吸头进行移液工作，有效防止气溶胶污染。
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Eppendorf实验室

队长是我

PCR的原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
PCR最有价值的应用领域就是对感染疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。扩展资料
标准的PCR过程分为三步：
1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

卡卡

可以去看一下研究pfu 或者Taq DNA聚合酶的硕博士论文，里面会有详细的原理及原理图，论文可从知网下载！