PCR技术为什么可以轻松进行定点突变？

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PCR技术为什么可以轻松进行定点突变？
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检验医师

1. PCR技术原理：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR),在引物参与下，由酶催化特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。
2. PCR技术简史：1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……



Khorana

1983年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪相对简单，数量很少的原始DNA分子进行几何级数的倍增，目的基因进行分析，鉴定。


1. PCR技术要求：（1）灵敏度高：1）皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平；
2）能从100万个细胞中检出一个靶细胞；
3）病毒检测的灵敏度可达3个RFU
4）细菌检测的最小检出率为3个细菌
（2）简便、快速
1）一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增
2）扩增产物一般用电泳分析
（3）对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA
2. PCR的类型和应用：1）研究：基因克隆，DNA测序，分析突变；
2）诊断：细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程；遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱；3）法医：犯罪现场标本分析；4）肿瘤，各种肿瘤检测

感恩由您

因为突变引物可以正常结合在模版上。

继续前进

在PCR过程中，通过引入含有错配碱基的引物，可以对目标基因实现定点突变，实现定点突变的大致的原理如下所示：


通过PCR技术对原目的基因进行定点突变，所获得的新基因片段，可以被连接到质粒载体，并被导入大肠杆菌（基因工程菌）。通过大肠杆菌的增殖，新基因片段可以在大肠杆菌中被表达生成新的蛋白质。在这里可以举一个利用PCR定点突变技术获取新的功能性产物的应用实例：
nisin是一种具有抑菌活性的细菌素（一种具有抑菌活性的小分子多肽），但是这类细菌素的抑菌谱较窄（能被nisin抑制的微生物种类极少）。为了获得具有更加广谱的细菌素或者活性更强的细菌素，我们可以将表达nisin的基因片段作为目的基因，通过PCR技术对目的基因进行定点突变，获得的新基因片段。将新基因片段连接到质粒载体，并导入大肠杆菌。通过大肠杆菌的增殖，新基因片段可以在大肠杆菌中被表达生成具有更广抑菌谱新型细菌素。可参考以下论文获得更具体的信息。

大力水手

不轻松，PCR技术是通过引物来引入定点突变的，就是引物故意设计一个错配碱基，再通过PCR将错配的碱基引入到PCR产物中，从而得到突变的PCR产物，然后将此产物装入到合适的载体中，再通过脂质体或者病毒感染生物体，不过这种突变方式是引入载体的方法，不能从根本上改变生物体的DNA序列，所以并不轻松，而且效率低下。