干货分享：细胞ROS是什么？如何检测？

生物科研实验室

众所周知，ROS在细胞生命，应激和死亡中具介导作用，今天来聊下ROS。 ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是细胞内产生的一种具有氧化活性的化学物质，包括过氧化氢、超氧阴离子等。ROS在正常生理条件下也会产生，但当其产生过多或清除不足时，会对细胞造成氧化应激，导至细胞损伤和疾病发生。检测方法目前有多种方法用于检测ROS，包括荧光染色法、电子顺磁共振技术（EPR）、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器以及基于荧光蛋白等七种。在这里，我们将着重介绍荧光染色法，以及其在检测细胞内ROS时的原理和操作步骤。检测原理目前，用于检测细胞内ROS最广泛采用的方法是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA（二氯荧光黄双乙酸盐）是一种可指示的探针，其本身不具有荧光，但可以自由穿过细胞膜。一旦进入细胞，它会被细胞内的酯酶水解成DCFH。由于DCFH无法穿过细胞膜，因此荧光探针会在细胞内积聚。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH，生成有荧光的DCF，且荧光强度与ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等设备，在最大激发波长480nm和最大发射波长525nm下检测荧光信号。检测步骤：1. 装载探针对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。
2. 检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。注意事项1、在完成探针装载后，务必充分清洗，去除未进入细胞的探针残余，以避免引发高背景信号。
2、探针装载和清洗完成后，可执行激发波长和发射波长的扫描，确保探针装载状况良好。
3、为降低各类误差，建议尽量缩短探针装载后至测定时的时间（刺激时间除外）。