ELISA的操作步骤是什么？

乔帮主

ELISA的操作步骤是什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/475581972

清风寡欲

ELISA试剂盒操作步骤
https://www.zhihu.com/video/1779537847474339840

      ELISA试剂盒操作步骤:

　　准备工作


　　取出试剂盒，平衡至室温(20-25℃)。

　　未用的板条与干燥剂请放回铝箔袋内，密封保存于4℃。

　　准备好所需的实验器材，例如移液器、离心管、试管架、洗瓶、吸水纸等。

　　准备标准品、检测样本、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液、洗板液、显色底物（TMB）、反应终止液等试剂。

　　加入标准品与检测样本


　　根据试剂盒说明书，使用合适的溶液（例如PBS、样品稀释液）稀释标准品，配制成一系列不同浓度的标准品工作液。

　　根据实验需求，对检测样本进行预处理，例如离心、过滤等操作，并进行适当的稀释。

　　将标准品工作液和检测样本分别加入到ELISA板的相应孔中，每孔加入100μl。

　　37℃避光孵育90min。

　　洗板


　　用洗板液轻轻洗涤ELISA板5次，每次洗涤时间为30秒，注意避免气泡产生。

　　将洗板液倒掉后，用吸水纸轻轻拍干板底，避免残留液滴。

　　加入生物素化抗体工作液


　　根据试剂盒说明书，使用合适的溶液（例如PBS、抗体稀释液）稀释生物素化抗体，配制成生物素化抗体工作液。

　　将生物素化抗体工作液加入到每个孔中(100μl/孔)，空白孔加入生物素化抗体稀释液(100μl/孔)。

　　37℃避光孵育60min。

　　洗板


　　用洗板液轻轻洗涤ELISA板5次，每次洗涤时间为30秒，注意避免气泡产生。

　　将洗板液倒掉后，用吸水纸轻轻拍干板底，避免残留液滴。

　　加入酶结合物工作液


　　根据试剂盒说明书，使用合适的溶液（例如PBS、酶结合物稀释液）稀释酶结合物，配制成酶结合物工作液。

　　将酶结合物工作液加入到每个孔中(100μl/孔)，空白孔加入酶结合物稀释液(100μl/孔)。

　　37℃避光孵育30min。

　　洗板


　　用洗板液轻轻洗涤ELISA板5次，每次洗涤时间为30秒，注意避免气泡产生。

　　将洗板液倒掉后，用吸水纸轻轻拍干板底，避免残留液滴。

　　加入显色底物


　　预热酶标仪，设置好检测程序。

　　将显色底物（TMB）加入到每个孔中(100μl/孔)。

　　37℃避光孵育15min。

　　加入反应终止液


　　将反应终止液加入到每个孔中(100μl/孔)，混匀后立即测量OD450值，保存数据。

　　注意：TMB显色液遇酸性溶液会迅速变色，因此加入终止液后要立即测量OD值。

　　数据分析


　　根据标准品和检测样本的OD值，在标准曲线软件或工具中建立标准曲线。

　　根据检测样本的OD值，在标准曲线上查找到相应的目标物质浓度。

　　试剂保存


　　实验完毕后，参照说明书保存未用完的试剂至有效期结束，注意避光、低温保存。

重要注意事项：

　　实验操作过程中注意无菌操作，避免污染。

　　每个步骤都要轻柔操作，避免产生气泡。

　　严格按照试剂盒说明书操作，避免误差。

　　实验结束后，及时清理实验台面，并消毒处理。

建议：

　　在正式实验前，进行少量样本的验证实验，确保实验步骤和试剂盒的匹配。

　　记录实验过程中的所有信息，包括试剂批号、操作时间、温度等，以便进行数据分析和实验复现。

继续前进

交流一波

感恩由您

一、实验目的

1. 检测生物样品中抗体、抗原、蛋白质和糖蛋白等物质的含量。
2. 药物药效学评价、筛选。
二、实验原理

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术，由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971年首次描述。该测定依赖于抗原-抗体相互作用的原理，并利用酶和比色检测来量化目标分子，主要用于检测和量化生物样品中特定蛋白质、肽、抗体或抗原的存在。ELISA测定通常应用于各个领域，包括临床诊断、药物研究和生命科学基础研究。



图1 ELISA原理图及分类 源自Excedr官网

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种：
直接ELISA：抗原通过一段时间的孵育被动地附着在塑料固相载体上，经过简单的洗涤后，通过添加与酶共价连接的抗体来检测抗原。孵育和洗涤后，通过添加色原/底物使酶活性产生颜色变化来显色。在规定的时间后通过化学手段终止酶活性后读取显色情况。在分光光度计中读取颜色。该方法相对简单，但它在灵敏度方面可能存在局限性，特别是当抗体-抗原相互作用相对较弱时。
间接ELISA：间接ELISA是在直接ELISA的基础上添加酶标二抗进行检测。抗原通过孵育被动附着到孔上，洗涤后，将抗原特异性抗体（一抗）与抗原一起孵育。 清洗孔并通过添加与酶共价连接的抗物种抗体（二抗）来检测结合的抗体。二抗对于产生所添加的第一抗体的物种具有特异性。



图2 间接ELISA步骤 源自RayBiotech官网

夹心ELISA：将捕获抗原的抗体（捕获抗体）附着在固相载体上，洗掉多余的未结合抗体后，添加抗原并被特异性捕获，通过直接ELISA或间接ELISA的形式检测抗原。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性，是最常见的ELISA实验形式。



图3 夹心ELISA步骤 源自RayBiotech官网

竞争性ELISA：在竞争性ELISA中，固定量的标记抗原与样品抗原（样本）竞争与固定化抗体的结合。信号与样品中抗原的浓度成反比。



图4 竞争ELISA分类及步骤 源自RayBiotech官网

三、仪器和试剂

ELISA试剂盒（本文以人IL-2作为检测对象举例说明）、细胞培养瓶、细胞计数仪、台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、多通道移液器、移液管移液器、10μL-1000μL移液器吸头、酶标仪、去离子水。
若无试剂盒则还需要：微孔板条、IL-2抗体（捕获抗体）、偶联生物素的抗人IL-2抗体（检测抗体）、链霉亲和素-HRP（HPR，辣根过氧化物酶）、包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、四甲基苄啶溶液（TMB，显色液）、硫酸溶液（终止液）、人IL-2蛋白标准品、PBS、吐温-20、牛血清蛋白（BSA）、透气封板膜。
四、实验步骤

1. 样品准备
a. 细胞上清样品，需将培养瓶内的细胞消化离心取上清即可（如800g，5分钟）。
b. 血清样品，将全血收集至不含抗凝剂的试管内，在室温下放置1小时，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1500g离心10分钟，取黄色上清即得血清。
c. 血浆样品，将全血收集至含抗凝剂的试管内，混匀后置冰上，4℃约1500g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆。
2. 确定样品测试组、标准品和空白组组所需的微孔条数量，每个浓度做两个平行重复，从支架上取出对应数量的微孔条，剩余储存在箔袋中，密封后在4℃储存。
3. 配制对应浓度的捕获抗体溶液、检测抗体溶液、包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、链霉亲和素-HRP（若使用试剂盒则没有此步骤或按试剂盒要求配制）。
4. 每孔加入100μL 捕获抗体溶液，用封板膜覆盖，4℃孵育过夜，过夜后舍弃舍板内溶液。
5. 每孔加入300-400μL洗涤液清洗五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干（若使用试剂盒则没有步骤4和5）。
6. 用样品稀释液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀释样品，以此确定样品IL-2的最佳检测浓度。
7. 配制梯度浓度的IL-2蛋白标准品，将工作浓度设置为1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL, 18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此浓度来绘制标准曲线。
8. 分别将样品、标准品、样品稀释液按照100μL/孔加入相应孔中作为标测试组、标准品组、空白组。
9. 将偶联生物素的抗人IL-2抗体按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆盖，室温避光孵育2小时。
10. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
11. 在所有孔加入100μL稀释后的链霉亲和素-HRP，用封板膜覆盖，室温避光孵育1小时。
12. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
13. 在所有孔中加入100μL TMB显色液。用封板膜覆盖，室温避光孵育30min。
14. 在所有孔中加入终止液50μL，混匀后立即测量A450值。
15. 计算每一组重复的标准品和样品的平均吸光度值。重复次数应在平均值的20%以内。
16. 绘制IL-2标准品标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
17. 结果示例图：



图5 不同实验条件处理后的NK细胞产生的IFN-γ和TNF-α含量对比[1] Zhang PF, Mol Cancer. 2020;19(1):110. Published 2020 Jun 27. doi:10.1186/s12943-020-01222-5



图6 不同模型小鼠体内在不同时间的磷酸化STAT3的表达水平[2] Allen MJ, J Nutr. 2014;144(8):1306-1313. doi:10.3945/jn.114.194407



图7 左图为免疫小鼠血清中抗sFGL1抗体的滴度，右图为小鼠腹水中2D7和4G7的抗体滴度[3] Zhang X, Front Immunol. 2021;12:670626. Published 2021 Apr 23. doi:10.3389/fimmu.2021.670626

五、注意事项

1. 对于血清样本不要剧烈摇晃以免溶血，且不能添加任何防腐剂或抗凝剂。在吸取时注意不要吸取白色或淡黄色沉淀，制备好的血清需置于冰上待用。
2. 若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。所有样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。不能使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
3. 对于血清或血浆样品，可以加入50μL样品分析缓冲液后加50μL样品；如稀释比例大，将样品与样品分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100μL。请注意记录好样品的稀释倍数。
4. 请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于检测限，请适当稀释或浓缩后再进行检测。
5. 如果是手洗板，注意洗涤液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，会造成背景值增高。
6. 特别注意：设计实验的时候要考虑实验孔的位置，保证甩掉洗涤液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开最好。同时注意甩掉洗液的动作翻转（从正上方旋转120-150度）要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体！甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。
7. 拍干最好用干净的吸水纸、滤纸或无尘布，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大
8. 复孔的吸光值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。
9. 每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值（如果没有做校正孔，则不需要减去）。
10. 实测数据会因试剂盒供应商、试剂供应商、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，因此每次实验都要重做标准曲线，供应商给提供的标曲用作辅助参考（如图9）。



图8 三家不同供应商IL-2 ELISA试剂盒提供的IL-2蛋白标准曲线

11. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。
12. ELISA结果图有多种展现形式，不拘泥于一种，选择合适的风格即可。
六、参考文献

[1] Zhang PF, Gao C, Huang XY, et al. Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 2020;19(1):110. Published 2020 Jun 27. doi:10.1186/s12943-020-01222-5
[2] Allen MJ, Fan YY, Monk JM, et al. n-3 PUFAs reduce T-helper 17 cell differentiation by decreasing responsiveness to interleukin-6 in isolated mouse splenic CD4⁺ T cells. J Nutr. 2014;144(8):1306-1313. doi:10.3945/jn.114.194407
[3] Zhang X, Zhu H, Zheng X, et al. A Double-Antibody Sandwich ELISA for Sensitive and Specific Detection of Swine Fibrinogen-Like Protein 1. Front Immunol. 2021;12:670626. Published 2021 Apr 23. doi:10.3389/fimmu.2021.670626


声明：本文章重在分享科研方法、资讯、传播知识。如有错漏之处，还请同仁指正。文章不构成任何投资建议，也非临床预防、诊断、治疗建议。未经许可严禁商业性转载，非商业性转载请注明出处。

检验医师

ELISA 步骤、试剂及注意事项
操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～10μg／ ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲 液洗 3 次，每次 3 分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37℃孵育 1 小 时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育 0.5～1 小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度 越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测 O·D 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后 测各孔 O·D 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1～10μg／ml，每孔加 0.1ml，4℃过夜。次日洗涤 3 次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37℃孵育 1 小时, 洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育 30-60 分钟，洗涤,最后一遍用 DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的 4、5、6。



品科研-生物试剂,化学试剂,科研试剂超市www.pinkeyan.com



品科研-生物试剂,化学试剂,科研试剂超市www.pinkeyan.com



品科研-生物试剂,化学试剂,科研试剂超市www.pinkeyan.com



品科研-生物试剂,化学试剂,科研试剂超市www.pinkeyan.com

试剂器材品科研-生物试剂,化学试剂,科研试剂超市www.pinkeyan.com
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59 克 NaHCO3 2.93 克 加蒸馏水至 1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2 克 Na2HPO4·12H2O 2.9 克NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至  1000ml
(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清、兔血 清等 血清与洗涤液配成 5～10％使用。
(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水 178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0 磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4 克／L)  25.7ml 0.1M柠檬酸(19.2 克／L) 24.3ml 加蒸馏水 50ml。
（6）TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml 无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS 使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
（8）抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40 孔或 96 孔，ELISA 检测仪，50μl 及 100μl 加样 器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3)   4℃冰箱，37℃孵育箱。
注意事项

1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份， 以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封闭。
2. 在 ELISA 中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。 不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观 察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好, 吸附时一般要求 PH 在 9.0～9.6 之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采 用 4℃18～24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0 和 10μg／ml 等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定(见酶标记 抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗 体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反 应，而本身无色。有些供氢体(如 OPD 等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如 TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以 10-30 分钟为宜。底物使 用液必须新鲜配制，尤其是 H2O2 在临用前加入。------------------------------------------------------------------北京德航五洲科技有限公司（简称德航五洲）以德起航，诗书五洲，寓意中国传统文化的 “厚德传家久、诗书五洲远”，德之基石，航行五洲，致力于成为科学服务行业生命科学产品（尤其围绕“试剂产品”）的优秀供应商。德航五洲零售商城：2020年初，德航五洲集团以全新的电子商务视角建设了线上零售商城---品科研超市，品科研超市：品科研-生物试剂,化学试剂,科学服务试剂超市-河北品科研生物科技有限公司，科研服务行业的一体化、一站式、正品直营的试剂零售平台。
公司官网北京德航五洲科技有限公司：北京德航五洲科技有限公司官网
旗下河北品科研科技电商平台：品科研-生物试剂,化学试剂,科学服务试剂超市-河北品科研生物科技有限公司
丁香通展示店：北京德航五洲科技有限公司_商铺首页_丁香通

队长是我

操作步骤方法一
用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二 用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。