HIV酶联免疫吸附是三代还是四代检测?

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HIV酶联免疫吸附是三代还是四代检测?
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长长的路

单纯抗体检测属于三代。

卡卡

一.实验原理

我们的上一个实验是Western Blot的实验目的是检测特定蛋白质的表达水平，在最后的数据处理中，我们采用的是灰度计算法，这是一种半定量法，因为灰度计算受到多种因素的干扰。今天我们学习的ELISA法（酶联免疫吸附法）用于定量检测特定蛋白质的表达量。我们今天检测的实验对象是小鼠血清的γ-干扰素。
1.抗原-抗体反应

（1）抗原是入侵机体的外源性物质，比如病毒、细菌以及其他机体的细胞等等，都属于抗原。
（2）抗体是机体免疫系统对特定抗原做出反应时所产生和释放的蛋白
（3）抗原和抗体的相互作用是免疫系统中重要的生物学过程，也正是因为抗原和抗体间有高度特异性的亲和力，我们可以根据抗原抗体的结合设计一系列的实验。这些实验技术的目的都是检测特定的抗原，属于免疫化学的技术。最经典的就是我们今天要学习的ELISA法，除此之外免疫组织化学、免疫细胞化学免疫和免疫沉淀等技术也都可以归属于这一类技术。
（4）在这些技术中，通用的关键技术在于如何利用抗体与抗原的结合实现定量的发光检测。
①通用的过程
1）一抗首先与抗原特异性结合，


2) 随后加入荧光团标记的二抗，二抗是可以结合一抗恒定区的抗体


3) 结合在一抗上的二抗可以直接通过监测荧光团的光吸收信号实现定量检测


4)理想的情况是一抗的结合数量等于抗原的数量，而二抗的结合数量等于一抗的数量，那么检测二抗的数量也就相当于检测抗原的数量。当然二抗上如果不直接连接荧光团，而是连接辣根过氧化物酶HRP或者是碱性磷酸酶AP，这些连接上去的酶可以特定催化特定的底物，产生发光反应，同样可以实现定量检测。


2.ELISA法（酶联免疫吸附法）
这一技术是用酶来标记抗原或者抗体的分析技术，它同样是以免疫学反应为基础的，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合，形成了一种定量检测未知抗体或抗原的技术。这种技术的灵敏度非常高，与所有的免疫化学技术相似，ELSIA技术有两大核心：①抗原或抗体的固相化，也就是将抗原或者抗体吸附在固相表面，这样有利于后续的系列洗涤操作，固相化的过程要保证吸附后的抗原或抗体的免疫学活性没有受到影响；②抗原或者抗体的酶标记，也就是抗原或者抗体上偶联了特地的酶，以利于后期的发光检测。当加入酶促反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与试样中待测物质的量直接相关。
（1）ELSIA法包括双抗体夹心法（三明治法）、竞争法，今天主要以双抗体夹心法为例。
（2）ELSIA法的实验原理
①第一步，我们将一抗固定在固相载体表面上，这各固相载体可以是96孔聚氯乙烯或者聚苯乙烯微孔板，这个过程我们称为包被。固相载体具有比较强的吸附蛋白质的性能，抗体或者蛋白质抗原吸附在上面之后，仍然可以保留自身的免疫活性。固相载体仅仅是作为载体和容器，它是不参与免疫反应的，抗原抗体或者其他分子可以通过包括疏水键、离子键、共价键和亲水键等等方式吸附到载体表面上，当然共价结合和亲水结合，需要引入其他的活性基团或者是对固相载体进行表面改性。


②第二步，微孔板与待检测的混合蛋白样品孵育，一抗固定在微孔板上，洗去未结合的抗体，并且用封闭液将孔中没有结合一抗的位点封闭之后，


③我们将待检测的蛋白质的检测样品加入微孔板内，与一抗共同孵育。这时候固定在微孔板上的一抗可以捕捉混合蛋白样品中的目标抗原






④第三步，我们洗去在这个捕捉过程中没有结合一抗的其他蛋白，随后我们加入二抗。当一抗与目标抗原结合完毕后，同样的我们需要用洗涤液洗去没有结合的蛋白样品，并且用封闭液将未结合蛋白一抗位点封闭，




⑤加入另一个可以结合目标蛋白的二抗，在这里二抗与一抗必须结合相同的抗原分子，但是二者识别的抗原表位不能重叠，否则就会产生位阻，抑制作用。




⑤第四步，洗去未结合的二抗，并且加入HRP或者AP的底物进行检测。二抗结合到一抗目标蛋白复合物之后，我们要洗去没有结合的二抗。在二抗上一般需要连接上标记物，这些标记物就是刚才的HRP或者AP，它们可以催化显色反应。在二抗上标记酶的情况下，我们检测时需要在微孔板内加入HAP或者AP的底物，在特定波长下，读取每一个孔的吸光值。




（3）ELSIA法的原理示意图


①三明治法和竞争法在识别抗原抗体反应上的差异？
三明治法的抗原的两个表位分别结合一抗和二抗，如果这个抗原没有两个表位供两个抗体结合，因此在竞争法中抗体只需要结合抗原的一个表位，随后结合了抗原的抗体与固定在板上的一抗结合。


②竞争性ELISA法的原理
（4）ELSIA法的分类
ELISA法灵敏度高，特异性强，准确性高，检测时间短，适合大量样品的检测和准确定量，因此广泛应用于食品安全监测、临床检测以及免疫实验分析，比如疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医监察。食品中的真菌和细菌检测、病人体内的激素、生物标志物、寄生虫及病原微生物检测等等。
二.实验步骤

1.实验流程





2.操作示范

三.结果处理与分析

ELISA法实验的结果处理还是紫外吸光度的检测，有些发光底物需要使用荧光吸收值进行检测，无论哪一种检测，我们最后都到的都是光吸收值。在使用酶标仪检测完毕之后，根据样品放置顺序，依次抄录各试样的吸收值。试样溶液的光吸收值都需先进行空白扣减，扣减后的光吸收值作为Y值，并以标准品γ干扰素的浓度为X值进行标准曲线的绘制。本次实验采用3个复孔，我们使用Graphpad Prism 软件进行数据处理。
四.实验注意事项

卡卡

三代检测！
酶联法是检测方法，具体三代四代最好辨认的方法是看有没有检测抗原。像您的检测只检测抗体为三代检测。

大力水手

酶联免疫吸附不是检测试剂，而是一种检测方法。
我们常见的HIV检测技术有HIV-1/2抗体检测、HIV核酸检测。常用HIV-1/2抗体检测，这里面包含的检测方法有以下几种：

• 酶联免疫吸附法(ELISA)
  
• 化学发光或免疫荧光法
  
• 免疫凝集法
  
• 免疫层析法
  
• 免疫渗滤法
  

酶联免疫吸附法里面包括：

• 只测抗体的三代试剂
  
• 抗原抗体联合检测的四代试剂
  
• 抗原抗体分开检测的五代试剂
  

你的这个上面是测抗体的，也就是三代试剂。结果为阴性，代表未感染HIV病毒。
祝健康~

卡卡

几代的指的是检测的标的及试剂，而不是方法，这个是抗体检测，应该是三代