cell子刊：敲低Nrf2基因能触发T细胞对实体肿瘤足够强大的抗肿瘤免疫反应，成为潜在靶点

医学研究

今天和大家分享一篇2024年8月发布在cell子刊关于肿瘤微环境的最新研究的文章。题目为《Targeting ROS-sensing Nrf2 potentiates anti-tumor immunity of intratumoral CD8+ T and CAR-T cells》。

根据先前的一项研究，已经提出肿瘤特异性OS相关基因NFE2L2 (Nrf2)与高度耗竭的TI T细胞密切相关。因此，我们检测了NFE2L家族在TI细胞中的表达，发现Nrf2的表达明显高于其他家族。此外，我们发现，与其他免疫细胞群相比，它仅在TI T细胞中显著增加。接下来，为了评估Nrf2表达是否影响抗肿瘤T细胞反应，我们使用Nrf2缺陷(Nrf2/)和Nrf2转基因(Tg)小鼠，其中Nrf2在人CD2 (hCD2)启动子的控制下过表达。Nrf2/和Tg小鼠的T细胞发育和稳态与野生型(WT)小鼠相当。
       为了探索Nrf2在肿瘤生长中的潜在作用，我们比较了皮下注射B16F10黑色素瘤、EL4淋巴瘤、MC38结肠癌或TC-1肺癌细胞的Nrf2/、WT和Nrf2Tg小鼠的肿瘤生长和存活情况。与WT和Nrf2Tg小鼠相比，Nrf2/小鼠的肿瘤生长明显降低，小鼠存活时间延长。此外，在Nrf2/小鼠中观察到肿瘤大小和重量减小。为了测试Nrf2/小鼠抗肿瘤反应的增强是否由T细胞介导，我们使用a-CD3抗体耗尽T细胞，发现T细胞耗尽显著增加Nrf2-/-小鼠的肿瘤生长。此外，T细胞耗竭并没有延长荷瘤Nrf2-/-小鼠的存活时间。T细胞，而不是B细胞，在Nrf2-/-小鼠的肿瘤排斥反应中起关键作用。因此，Nrf2缺失以T细胞依赖的方式促进抗肿瘤反应。接下来，我们在mRNA和蛋白水平上确定了WT和Nrf2/ TI T细胞的细胞因子谱，观察到TI Nrf2/ T细胞中炎症因子(包括Ifng和Il-17)的增加和抗炎因子的减少。具体而言，与TI Nrf2-/- T细胞相比，TI WT和Nrf2Tg T细胞炎症蛋白如干扰素g (IFNg)的表达显著降低。这些结果表明Nrf2缺失增强了TI-T细胞的活性。

1.Nrf2跟肿瘤里的极度疲劳的T细胞有很大关系，发现Nrf2的表达比其他类似的基因要高得多，与其他免疫细胞相比，T细胞里的Nrf2表达得更多。
2.测试Nrf2影响T细胞对抗肿瘤的能力，两种小鼠实验：一种是完全没
有Nrf2基因的（Nrf2-/-），另一种Nrf2基因特别多的（Nrf2-Tg），结果显示，没有Nrf2基因小鼠身上的肿瘤长得慢，活得也更久。
3.用抗体去除小鼠的T细胞，没有T细胞后，这些小鼠的肿瘤又开始疯长
了。这说明T细胞在这个过程中起了关键作用。
4.没有Nrf2小鼠的T细胞会产生更多的“战斗信号”（比如IFNg和
IL-17），同时产生更少的“停止战斗信号”（比如IL-4和IL-10）。
1.三种小鼠T细胞回输做动物实验：没有Nrf2基因的小鼠（Nrf2-/-），正常的小鼠（OT-I），Nrf2基因特别多的小鼠（Nrf2TgOT-I），没有Nrf2基因的小鼠的T细胞表现最好，肿瘤长得最慢，而且T细胞的数量也更多。
2.这些没有Nrf2基因的小鼠的T细胞不仅数量多，还能在小鼠体内坚持更
长时间，甚至变成了能记住肿瘤的“记忆细胞”，随时准备再次战斗。
3.没有Nrf2基因的小鼠的T细胞还能帮助其他免疫细胞（如树突状细胞）
更好地工作，抑制那些有害的细胞（如MDSCs），这样整个免疫系统都变得更强大，更能对抗肿瘤。
1.先确认了一件事情：有肿瘤小鼠体内的髓源性抑制细胞（MDSCs）会分泌更多的过氧化氢（H2O2），正常小鼠则不会。
2.过氧化氢（H2O2）会增加CD8+T细胞中的Nrf2基因和蛋白质的表
达。不过，Nrf2基因的缺失并不会显著影响T细胞的死亡，不管是正常的还是没有Nrf2基因的CD8+T细胞，在受到刺激时都能正常分裂。
3.当T细胞受到TCR刺激时，Nrf2的表达会在前6小时内增加，但在16小
时后又会下降。这表明Nrf2在复杂的免疫反应中有一定的调节作用。
4.在后续TCR刺激下，经过过氧化氢处理的正常CD8+T细胞产生的干扰
素-γ（IFNγ）会显著减少，但没有Nrf2基因的CD8+T细胞不会。
5.在过氧化氢环境下，正常CD8+T细胞中的TCR信号通路受到了抑制，
而没有Nrf2基因的CD8+T细胞TCR信号通路依然保持活跃。这些结果表明，感受氧化应激的Nrf2会抑制T细胞的激活信号，而没有Nrf2基因的CD8+T细胞即使在充满氧化物的环境中也能维持其效应功能和正常激活状态。
1.为了研究Nrf2作为一种转录因子是如何影响T细胞在肿瘤微环境（TME）中的基因表达的，对肿瘤浸润的野生型（WT）T细胞和没有Nrf2基因的（Nrf2-/-）T细胞进行了RNA测序分析。
2.没有Nrf2基因的T细胞在激活相关基因（如LAT、TEC和PD1）、细胞
毒性相关基因（如GZMA、GZMK、CD244a和TNFRSF8）以及干扰素信号相关基因（如Ifi30、Ifi205和Irf5）的表达上都更高。
3.耗竭相关基因（如CTLA4、TIGIT、LAG3和Nr4a1）的表达在没有Nrf2基因的T细胞中则显著降低。
   为了将Nrf2效应转化为人类T细胞免疫疗法，我们评估了Nrf2在受刺激的人CD8+T细胞中的表达动力学。我们证实，在ROS和TCR刺激下，人类NRF2表达上调，与小鼠CD8+T细胞相似。为了寻找具有MDSC TME的最佳异种移植动物模型，我们研究了免疫缺陷动物模型(包括NSG和NOG小鼠)实体瘤形成后MDSCs的频率，发现MDSCs明显浸润或分化到NOG小鼠的TME。与NSG小鼠相比，荷瘤NOG小鼠脾MDSC中ROS的产生被显著诱导。为了证实CAR-T细胞的抗肿瘤作用是否被MDSCs抑制，我们将CAR-T细胞转移到荷瘤NOG和NSG小鼠身上。在产生MDSCs的NOG小鼠中，CAR-T细胞的抗肿瘤反应显著降低，而在NSG小鼠中则没有。这意味着CAR-T细胞的细胞毒性作用受到富含ROS的TME通过MDSCs的严重影响。
     为了确定靶向CAR- T细胞的Nrf2是否能够克服由MDSCs形成的富含ros的免疫抑制性TME，我们使用短发夹RNA (shRNA)-Nrf2-CD19 CAR载体生成Nrf2KD人CD19-CAR-T (Nrf2KD CAR-T)细胞。我们评估了Nrf2KD CAR-T细胞的体外细胞毒性，并证实Nrf2KD CAR-T细胞对IM-9有效，无论H2O2处理如何，而WT CAR-T细胞在H2O2处理后显著失去细胞毒性。将体内CAR-T细胞移植到IM-9异种移植NOG模型后， Nrf2KD CAR-T细胞表现出比对照CAR-T细胞和人T细胞更高的抗肿瘤功效。与小鼠肿瘤模型一致，与对照CAR-T细胞相比，Nrf2KD CAR-T细胞在脾脏和TILs中的数量显著增加，而在转移后很少检测到这些细胞。此外，Nrf2KD CAR-T细胞在脾脏和TILs中产生的IFNg显著增强。与荧光活化细胞分选(FACS)数据一致，Nrf2KD CAR-T细胞组的血清IFNg水平也比其他组升高，而所有组的IL-6和IL-1b水平相当。值得注意的是，Nrf2KD CAR-T细胞组脾脏和TIL中MDSCs的频率和数量明显低于对照CAR-T细胞组和人T细胞组。Nrf2KD CAR-T细胞组的ROS产量显著降低。这些数据表明，在CAR-T细胞免疫治疗中靶向Nrf2可以促进实体癌的治疗效果。
总结该文章明确地确立了Nrf2在肿瘤通过氧化应激（OS）诱导来进行免疫逃逸中的关键作用。赋予肿瘤特异性T细胞抵抗氧化应激的能力对于保持这些细胞的效应功能的重要性。进一步说，通过Nrf2敲低（Nrf2KD）工程改造肿瘤特异性T细胞使其具备氧化应激抵抗能力，这本身可能就足以在实体肿瘤模型中驱动强大有效的抗肿瘤反应。尽管还需要进行更多使用实体肿瘤细胞系的研究，但仅仅通过调节Nrf2的表达就能触发对实体肿瘤足够强大的抗肿瘤免疫反应。这一发现对于未来开发新的免疫治疗方法提供了新的思路和方向。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001624005410