Western Blotting 之三

笑看风云

举一个例子。
实验目的：初探mutant p53是不是通过蛋白酶体的泛素化降解的。
实验设计：选一个阳性对照细胞，A549 有wt p53；选一个实验细胞 H1975 有mutant p53 R273H 突变；选一个抑制剂MG132, 10uM。定MG132的作用时间点 0，1，2，3，4，5，6小时 （大部分细胞在MG132 10uM 6小时以后都开始要挂了）。
Day 0. seed A549 cells in 6-well-plate, seed H1975 cells in 6cm dishes (because H1975 is bigger than A549).make sure cells will reach about 60-70% confluence next day.
Day 1.
8AM -----  make MG132 10uM in cell culture medium, mix well, and let it consolidate for about 1h, meanwhile, change all of the wells with fresh complete medium.
9AM ----- 吸走一个well/dish的培养液，加 MG132 10uM的培养液，此为6小时之样品；
10AM，11Am，12PM，1PM，2PM 如法炮制。准备好1%SDS lysis buffer, 用之前加上benzonase，混匀，室温。
3PM开始收样本。倒掉所有培养液（快点），温PBS洗三次（要快点）。尽量吸走所有PBS，6孔板的每孔加100ul之lysis buffer，6cm dish 加120-150ul之lysis buffer。都在室温下操作，刮下来，刚开始刮，会粘粘的，那是DNA跑出来了，一会就稀了。室温下收100ul （A549）120ul (H1975), BCA法蛋白浓度，算蛋白浓度，算2.5ug, 5ug, 10ug, 20ug 总蛋白之体积，大约需要40-50分钟。期间，样本中加laemmlli buffer, 可以煮，也可以不煮。-80C保存。一天的工作结束。
次日，跑胶。选15个孔的胶，两边加protein ladder。注意：关键是0点对照样本，即A549 0h, H1975 0h,尤为重要，跑胶还可可能会有边沿效应，会影响到第一个孔，和最后一个孔的条带，所以胶的第一个和最后一个孔，要斟酌。
要看p53，用Santa cruz的DO-1抗体，1:2000稀释。A549样本上10ug，H975 样本上2.5ug。
看GAPDH, 用santa cruz 的那个看抗体，1:10000稀释，上5ug.
试着看看NRF2，因为NRF2的量可能不高，各个样本都上10ug.
尽量使各个孔内上样的体积，都差不多，不够的，可用1X的leammlli buffer 补。
然后，----，然后，----，western 做完了，分析条带。

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