关于流式的一些基础，大佬请绕道

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（自学笔记，仅供参考，欢迎指正）
1. 简介

流式细胞术是一项基于激光的技术，用于检测细胞或颗粒特性，可在细胞分子水平上对单个细胞或其他生物粒子就行多参数、快速的分析，可高速分析上万个细胞。
流式细胞术的常用方法包括：活细胞的荧光激活细胞分选术（根据荧光标记将一个细胞群分为多个亚群）和免疫表型 （通过是否存在特征性内源性细胞标志物来识别细胞群 ）。
2. 三个概念

2.1 FSC/SSC

FSC（Forward Scatter）前向散射，用于分辨细胞的大小；SSC（Side Scatter）侧向散射，用于分辨细胞的复杂程度。
话不多说，直接上图：



单个细胞通过系统后激光照射，记录前向和侧向散射参数

2.2 门（Gate）

根据不同的参数确定所要研究的细胞群即为圈门或设门，常用的设门方法包括阈值设门，散射光设门等。圈完之后，可得到统计相关的数值，如细胞数和缩圈细胞占总细胞数的百分比等。



圈门，可分析特定性质的细胞群

2.3 补偿（Compensation error）

不同的荧光染料具有不同的发射光谱的波长范围，当同时使用两种波长范围有重叠荧光染料时，荧光叠加总是存在的，将这一叠加分别计算为两种荧光信号的过程， 即为调“补偿”，以确保特定检测器检测的荧光仅来自目标荧光染料。



不同荧光信号的重叠

3. 荧光染料的选择

对于多色实验，需了解荧光染料之间的光谱重叠，以便最大限度地减少荧光溢出等问题。
荧光染料图表，可快速识别荧光染料中任何可能重叠的光谱。
在光谱被覆盖的情况下，需要考虑荧光基团相对于抗原表达水平的亮度。总的来说：

• 如果抗原表达水平较低或不明或细胞数量较少，应使用较明亮的荧光染料，例如 PE
  
• 如果抗原表达水平较高或细胞数量较多，可以使用较暗的荧光染料，例如 PerCP
  

4. 样本

4.1 检测样本制备

以下是关于流式细胞术样本制备的一些重要提示：

• 最大限度地减少非特异性结合 —— 使用 BSA 或 FBS 作为封闭剂。
  
• 最大限度地减少抗体与 Fc 受体的结合 —— 在样本染色期间加入 10% 同源血清或 5 mg/mL 未标记的 IgG。
  
• 如果研究细胞内标志物，透化细胞膜 —— 使用低浓度的非离子洗涤剂（最高 0.1%）。
  
• 如果使用活细胞，防止细胞表面蛋白的内化 —— 所有步骤在冰上进行，使用前在 4℃ 下冷藏试剂。
  
• 防止细胞损伤 —— 避免出现气泡、剧烈涡旋、更换缓冲液时吸出全部溶液以及过度离心。
  
• 防止细胞死亡引起的结块 —— 添加 DNAse I（25 - 50 μg/mL）和 5 mM MgCl2。
  
• 防止阳离子依赖型细胞粘附 —— 使用不含 Ca2+/Mg2+ 的缓冲液。您最多可以添加 5 mM EDTA，以进一步防止细胞粘附。在此情况下，您应该使用 BSA（0.1%-1%）或经透析的 FBS（1%-5%），因为未透析的 FBS 会取代 Ca2+/Mg2+。
  
• 使用单细胞悬液 —— 如果可能，使用细胞滤网过滤器过滤样本。如果没有，可以使用尼龙网筛，但这样可能会损失细胞。
  
• 防止堵塞系统 —— 将细胞浓度维持在合理的浓度内（1E6 至1E7个细胞/mL）。
  

4.2 设置对照

• 空白对照：未染色对照，以确定阴性细胞群的位置
  
• 同型对照：与一抗同型的抗体，以确定由非特异性抗体结合引起的背景
  
• 荧光减一(FMO)对照：多色方案时，需设置每一种染料的少一色对照，方便针对某一种颜色染料的圈门
  
• 生物学对照：已知的阳性和阴性样本的对照
  

5. 实验方案

流式细胞术常用于检测细胞表面标志物，如 CD 蛋白，也可用于检测细胞内蛋白，如转录因子。
5.1 直接染色

• 单细胞洗涤  建议在冰上进行，1e5-1e6个细胞/100ul，buffer可选择PBS+1%血清或PBS+1%BSA，离心，去上清
  
• 封闭  可采用上述细胞洗涤buffer，离心，4℃静置1-2h，离心洗涤细胞两次，去上清
  
• 孵育一抗  依旧可采取相同buffer，对于直接流式细胞术，荧光基团直接与一抗偶联，4℃暗处静置15-45min，离心洗涤细胞至少两次，去上清，放置在暗处可避免荧光染料快速发生光淬灭
  
• 固定(optional)  根据仪器和具体分析实验添加一定体积4%多聚甲醛或70%冰乙醇，在暗处放置15-30min后离心去除。固定时基本杀死了所有的细胞，这样的好处是抗体与细胞表面的抗原结合更稳定，因此，样本不需要在染色后立即分析，可在冰箱中放置一段时间；另一方面，固定也是出于生物安全性考虑，可降低实验员由于检测样本的感染性导致的安全隐患。然而，固定的缺陷就是无法分辨死细胞，固定也会改变光散射特性，并可能增加自发荧光，因此可能需要调整仪器设置。
  
• 流式细胞仪上机分析  重悬细胞后上机
  

直接染色与间接染色

5.2 间接染色

在间接流式细胞术中，荧光基团与结合一抗的二抗偶联 —— 这样可以通过额外的方案步骤来扩增信号。
与上述直接流式分析方案不同的是，孵育的一抗中未偶联荧光染料，但可以偶联生物素或其他标记分子，洗涤之后，加入荧光标记的二抗，例如，若一抗偶联生物素，则使用亲和素或链霉亲和素的荧光二抗。接下来的步骤与上述相同。
5.3 胞内染色

改进的基本免疫荧光染色和流式细胞分析操作步骤可用于在单细胞水平上同时流式细胞分析表面分子和细胞内抗原。通常，细胞用甲醛固定以稳定细胞膜，然后用破膜剂或酒精透化，使得抗细胞内抗原的抗体可以在细胞内进行染色。
皂素或洋地黄皂苷是常用的可诱导可逆透化试剂，也可以使用Triton或Tween等洗涤剂，诱导不可逆透化。
应将透化剂加入抗体结合的每一步使用的buffer中，以确保细胞维持通透状态。
染色细胞内的蛋白质时，重要的是要考虑它们的位置，因为这可能决定了最优的操作步骤和缓冲系统。
步骤

• 固定细胞  4%冷的多聚甲醛固定20分钟，离心，洗涤
  
• 0.2-0.5%Triton X-100通透10min，离心，洗涤
  
• 封闭
  
• 孵育一抗  4度过夜或者37℃孵育2h
  
• 孵育二抗
  
• 上机
  

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